尹小萍，陈　柯，谢锦强，黄世光△(暨南大学医学院口腔医学系，广东广州5063;广州市妇女儿童医疗中心口腔科，广东广州5063)

肥大细胞转化生长因子β在人慢性根尖周病组织中的表达*

尹小萍1，陈柯2，谢锦强1，黄世光1△
(1暨南大学医学院口腔医学系，广东广州510632;2广州市妇女儿童医疗中心口腔科，广东广州510623)

［摘要］目的:本研究旨在观察不同类型慢性根尖周病组织中肥大细胞( mast cells，MCs)的分布，分析转化生长因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)在MCs上的表达情况，探讨类胰蛋白酶( tryptase) -TGF-β双阳性MCs在慢性根尖周病免疫病理中的作用。方法:共收集78例样本，分为3组: ( 1)根尖肉芽肿组25例; ( 2)根尖囊肿组25例; ( 3)正常对照组28例。组织标本经4%甲醛固定48 h以上。石蜡包埋、制备组织连续切片。HE染色，观察其组织学改变;采用甲苯胺蓝染色法观察各组标本组织中MCs的数量及MCs脱颗粒情况;采用免疫荧光双染色法，在荧光显微镜下观察各组标本组织中tryptase-TGF-β双阳性MCs的数量。结果: ( 1)与正常对照组相比，两组慢性根尖周病组织中tryptase-TGF-β双阳性MCs密度显著增多( P＜0. 01) ; ( 2)根尖囊肿组tryptase-TGF-β双阳性MCs密度明显高于根尖肉芽肿组( P＜0. 01) ; ( 3)与甲苯胺蓝染色法相比，tryptase-TGF-β免疫荧光双染色法结果中各组标本组织的MCs密度显著增多( P＜0. 01)。结论:慢性根尖周病组织，尤其是根尖囊肿组织中tryptase-TGF-β双阳性细胞明显增多，提示tryptase-TGF-β双阳性MCs可能在慢性根尖周病中的致病过程，尤其在根尖周囊肿纤维组织形成中发挥作用。Tryptase免疫荧光染色法比传统鉴别肥大细胞的甲苯胺蓝染色法更灵敏。

［关键词］慢性根尖周病;肥大细胞;类胰蛋白酶;转化生长因子β

根尖周病是由来源于感染根管的细菌及其代谢产物经根尖孔扩散至根尖周组织所致。机体的免疫防御机制无法完全消除根尖周的感染，因而形成伴随根尖周骨组织吸收破坏的慢性病损［1］。转化生长因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)是细胞生长的双重调节剂，在炎症、组织修复、胚胎发育、细胞的生长、分化和免疫功能方面都有重要的调节作用，与肿瘤发生发展、自身免疫和纤维化疾病等均有密切关系［2］。考虑到肥大细胞( mast cells，MCs)在过敏性和炎症性疾病中的作用及TGF-β对免疫细胞的抑制作用，TGF-β可能具有通过旁分泌或自分泌方式抑制MCs活性的功能［2］。我们前期研究已经表明MCs的募集和脱颗粒［3］、MCs干细胞因子( stem cell factor，SCF)与根尖周病免疫病理密切相关［4］，提示MCs及其相关细胞因子在根尖周病的发病及病理过程中起重要作用。目前，有关参与根尖周病MCs 的TGF-β表达情况还未见报道。因此，本研究分别采用甲苯胺蓝染色法和免疫荧光双染色法，观察不同类型慢性根尖周病组织中MCs的分布，分析TGF-β在MCs上的表达情况，探讨类胰蛋白酶( tryptase) -TGF-β双阳性MCs在慢性根尖周病免疫病理中的作用。

材料和方法

1研究对象

1.1病例选择选择2011年9月～2013年6月期间在暨南大学荔湾口腔教学医院临床诊断为根尖囊肿和根尖肉芽肿接受根尖刮治手术并经病理检查确诊的病例50例，其中根尖肉芽肿25例［22～60岁，平均( 43. 2±11. 9)岁］，根尖囊肿25例［24～64岁，平均( 45. 9±11. 8)岁］。正常对照组28例［年龄18～23岁，平均( 20. 5±4. 3)岁］为正常牙周膜，来自2013年6～9月期间因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，所有这些前磨牙牙根发育完全并且没有根尖周病。所有患者均没有系统性疾病而且至少2个月前停止使用抗生素。样本收集之前取得患者的书面知情同意书。

1.2分组及取材( 1)正常对照组:因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共28例; ( 2)根尖肉芽肿组: X线显示患牙根尖周有圆形或椭圆形密度降低区，直径＜1 cm，边界清楚，组织学检查见明显的炎症细胞浸润，并无鳞状上皮衬里; ( 3)根尖囊肿组: X线显示患牙根尖周有圆形或椭圆形密度降低区，直径＞1 cm，边界清楚有白色射阻线包绕，组织学检查见根尖区组织存在部分或全部上皮覆盖，囊肿表现为完整的囊腔，囊腔为一定厚度的复层鳞状上皮覆盖。上皮层可见明显炎症细胞浸润，纤维组织层以胶原纤维为主，未见明显的炎症细胞浸润。

2实验方法

2.1组织标本采集、处理与观察根尖肉芽肿和根尖囊肿标本是在进行根尖刮治手术时取得的根尖周病变组织。正常对照组标本取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，用无菌刀片将牙周膜从牙根上刮取。标本立即固定于4%甲醛溶液中48 h以上，经脱水、透明、浸蜡、包埋，制备成5 μm厚度组织连续切片。由2名病理医师盲法观察各组标本的组织学改变。

2.2甲苯胺蓝染色与观察组织切片通过常规脱蜡、酒精复水，常温下甲苯胺蓝液染色过夜，最后中性树胶封片。2名病理医师于光学显微镜下观察组织切片中MCs形态及脱颗粒情况并计数。在400倍视野下对每张切片中全部MCs计数，并记录每张切片的组织面积大小。计算各组MCs及脱颗粒MCs密度。MCs密度( mm－2) =每张切片中MCs总数/每张切片的组织面积;脱颗粒MCs密度( mm－2) =每张切片中脱颗粒MCs总数/每张切片的组织面积。

2.3Tryptase-TGF-β双阳性MCs免疫荧光双染色

抗tryptase的I抗( Abcam)，稀释浓度为1∶200;抗TGF-β的I抗( Santa Cruz)稀释浓度为1∶100; II抗为山羊抗鼠IgG( H + L) Alex Flour 555( Cell Signaling)，山羊抗兔IgG( H + L) Alex Flour 488( Cell Signaling)，稀释浓度为1∶200。组织切片通过常规脱蜡、乙醇复水，柠檬酸盐缓冲液微波修复、山羊血清封闭，I抗孵育，避光条件下II抗孵育荧光染色后，抗荧光淬灭封片液封片，立即在荧光显微镜下观察。2名病理医师于免疫荧光显微镜下观察到MCs均表达有TGF-β，从而对各组实验标本中的tryptase-TGF-β双阳性MCs计数并计算各组tryptase-TGF-β双阳性MCs密度。在400倍视野下对每张切片的tryptase-TGF-β双阳性MCs计数，并记录每张切片的组织面积大小。Tryptase-TGF-β双阳性MCs密度( mm－2) =每张切片中tryptase-TGF-β双阳性MCs总数/每张切片的组织面积。

3统计学处理

所有数据以均数±标准差( mean±SD)表示，采用SPSS 13. 0统计软件进行分析。不同组间甲苯胺蓝染色MCs密度及每平方毫米tryptase-TGF-β双阳性MCs数目的比较采用非参数检验——Kruskal-Wallis H检验; 3组之间存在差别则进行3个独立样本两两比较的Nemenyi法检验。不同组间甲苯胺蓝染色法和免疫荧光双染色法MCs密度的比较采用非参数检验——配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验。以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1组织学观察

正常对照组未见明显炎症细胞浸润;根尖肉芽肿组可见大量炎症细胞浸润，主要为单核细胞、淋巴细胞和浆细胞呈灶性浸润，其中巨噬细胞样细胞和中性粒细胞呈散在浸润;根尖囊肿组上皮层表现为细胞间水肿，上皮下见大量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润;纤维组织层以胶原纤维为主，未见明显的炎症细胞浸润，见图1。

Figure 1.The histological changes of the specimens (×400).A: healthy control; B: periapical granuloma; C: the epithelial layer of periapical cyst; D: the fibrous tissue area of periapical cyst.图1　各组标本组织学观察

2甲苯胺蓝染色

正常对照组的健康牙周膜组织中可见正常寄居的MCs，数量极少;根尖肉芽肿组与正常对照组相比，MCs的数量有所增加，MCs呈圆形或卵圆形，细胞边缘整齐光滑，胞质颗粒均匀，部分MCs呈轻度、中度脱颗粒;根尖囊肿组可见大量MCs定位于囊性上皮稍下方、结缔组织和上皮内区域，染色较深，形态多样，MCs呈明显脱颗粒现象，部分MCs崩解，异染性颗粒散落在细胞外，见图2。

各组标本组织中甲苯胺蓝染色MCs及脱颗粒MCs密度比较见图3。与正常对照组相比，两组慢性根尖周病组织中MCs密度显著上升( P＜0. 01)，且根尖囊肿组的MCs密度明显高于根尖肉芽肿组( P＜0. 05) ;与正常对照组相比，两组慢性根尖周病组织中脱颗粒MCs密度显著上升( P＜0. 01)，且根尖囊肿组的脱颗粒MCs密度明显高于根尖肉芽肿组( P＜0. 05)。

3Tryptase-TGF-β双阳性MCs免疫荧光双染色结果

各组标本组织中MCs均表达有TGF-β。正常对照组的健康牙周膜组织中仅可见少量散在分布的tryptase-TGF-β双阳性MCs;根尖肉芽肿组的根尖周病变组织中tryptase-TGF-β双阳性MCs数目明显增多;根尖囊肿组的根尖周病变组织囊性上皮稍下方、结缔组织和上皮内tryptase-TGF-β双阳性MCs数目显著增多，见图4。

Figure 2.Representative photomicrographs of MC infiltration with toluidine blue staining.图2　各组标本甲苯胺蓝染色观察

Figure 3.The densities of MCs and degranulated MCs with toluidine blue staining.Mean±SD.n = 25～28.＊＊P＜0. 01 vs healthy control;△P＜0. 05 vs periapical granuloma.图3　各组标本组织中甲苯胺蓝染色MCs及脱颗粒MCs密度

各组标本组织中的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度( mm－2)见图5，结果显示3组标本组织中的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度不同( P＜0. 01)，其中根尖囊肿组tryptase-TGF-β双阳性MCs密度最高。Nemenyi检验分析结果显示:正常对照组与根尖肉芽肿组的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度之间存在显著差异( P＜0. 01) ;正常对照组与根尖囊肿组的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度之间有显著差异( P＜0. 01) ;根尖囊肿组的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度明显高于根尖肉芽肿组( P＜0. 01)。

4甲苯胺蓝染色与免疫荧光双染色MCs密度的比较

各组标本甲苯胺蓝染色与免疫荧光双染色MCs密度的比较见图6。结果显示与甲苯胺蓝染色结果相比，免疫荧光双染色法结果中各组标本组织的MCs密度显著增多( P＜0. 01)。这提示trypatse免疫荧光染色法比传统鉴别肥大细胞的甲苯胺蓝染色法灵敏度更高。

Figure 4.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-TGF-β immunofluorescence double staining (×400).图4　各组标本组织中tryptase-TGF-β阳性MCs

Figure 5.The density of tryptase-TGF-β positive MCs.Mean± SD.n =25～28.＊＊P＜0. 01 vs healthy control;△P ＜0. 05 vs periapical granuloma.图5　各组标本组织中tryptase-TGF-β双阳性MCs密度

Figure 6.The comparison of the MC densities determined by toluidine blue ( TB) staining and double immunofluorescence ( IF) staining.Mean±SD.n = 25～28.＊＊P＜0. 01 vs MCs-TB.图6　各组标本甲苯胺蓝染色与免疫荧光双染色MCs密度比较

讨论

来源于感染根管的微生物是导致根尖周疾病的主要因素，细菌及其毒性产物经根管系统扩散至根尖周组织，启动机体免疫防御机制，导致各种炎症细胞及破骨细胞浸润，并产生多种CKs，导致根尖周组织的破坏和骨吸收［5］。感染根管中的革兰氏阴性菌的细胞壁成分脂多糖( lipopolysaccharide，LPS)能刺激中性粒细胞、巨噬细胞和MCs等释放多种促炎细胞因子，如IL-1、TNF-α、TGF-β和PGE2等，同时能激活破骨细胞，导致根尖周牙骨质和牙槽骨的吸收［6］。

传统观点认为，MCs主要参与I型超敏反应，抗原性物质与MCs表面的IgE结合后可导致MCs膜结构变化，发生脱颗粒释放组胺、白三烯等一系列生物活性肽，介导速发型过敏反应，从而导致或加剧根尖周组织水肿、疼痛、患牙伸长感、咬合痛等临床症状［7］。在根尖周肉芽肿和囊肿浸润的炎症细胞中，观察到一定数量的MCs，提示MCs参与根尖周病的致病机制［8］。然而，也有学者并不支持MCs介导的速发型过敏反应在根尖周病中发挥作用［9-10］。因此，有关MCs在根尖周疾病中的作用，目前尚无一致的看法。

研究显示MCs和巨噬细胞参与根尖囊肿的发病机制［11］。Márton等［12］观察到根尖周病变的纤维囊中存在大量的MCs，而在根尖肉芽肿中没有发现MCs。de等［13］在根尖囊肿的炎症病变区观察到MCs数量增多，同时在病变的深层组织中出现明显的脱颗粒现象，提示MCs与牙源性病变的炎症反应和囊性病变有关。Drazic等［14］观察到根尖囊肿的MCs数量比肉芽肿多，且MCs主要出现在根尖周病变组织的炎性浸润和成纤维细胞区域。Ledesma-Montes等［15］观察到MCs在有上皮增生的肉芽肿和炎症浸润区数量增加，并出现明显的脱颗粒，提示MCs与根尖周炎症进程的发生、发展和持续存在密切关系。本研究，我们采用甲苯胺蓝染色法对25例根尖肉芽肿、25例根尖囊肿和28例正常牙周膜进行检测，结果显示两组慢性根尖周病组织中MCs和脱颗粒MCs数量较正常对照组明显增多，且根尖囊肿组MCs和脱颗粒MCs数量均明显高于根尖肉芽肿。我们的研究结果与多数研究者的结果一致，提示MCs参与根尖周病变过程。

TGF-β超家族由结构相关的多肽生长因子组成，是一组调节细胞增殖和分化的蛋白质家族。TGF-β在炎症、组织修复、胚胎发育、细胞生长、分化和免疫功能方面均有重要调节作用，参与自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、纤维性病变和肿瘤等的病变过程［2］。TGF-β对多种细胞的生长、分化具有双重调节性，根据细胞的类型及其分化状态或试验条件不同，起抑制或激活作用。考虑到MCs在过敏性和炎症性疾病中的作用及TGF-β对免疫细胞的抑制作用，TGF-β可能具有通过旁分泌或自分泌方式抑制MCs活性的功能［2］。研究表明，TGF-β可以根据MCs的亚型、成熟或激活状态，对MCs释放介质产生上调或减弱的作用［16］。研究表明，由MCs或其它细胞产生的TGF-β1参与炎症级联反应，延迟并可逆性抑制IgE介导的MCs过敏反应［17］。TGF-β被认为在慢性肾病( chronic kidney disease，CKD)中通过诱导肾结构纤维化发挥重要作用［18］。TGF-β1能控制肾脏的炎症反应，同时也能促进肾脏纤维化的发展，是减少或干预慢性肾病恶化的一个潜在药物学目标［19］。

目前关于MCs细胞因子参与根尖周病的致病机制不详，对参与根尖周病MCs的TGF-β表达还未见报道。因此，本研究我们采用免疫荧光双染色法，分析TGF-β在MCs上的表达情况。结果显示:与正常对照组相比，慢性根尖周病组织中的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度明显升高;根尖囊肿组的tryptase-TGF-β双阳性MCs密度明显高于根尖肉芽肿组，结果提示tryptase-TGF-β双阳性MCs可能在慢性根尖周病的致病机制，尤其在根尖周囊肿的纤维组织形成中发挥作用。因此，我们可以推断TGF-β是主要的抗炎因子之一，它在MCs中表达的生物学意义可能是稳定炎症反应，修复受损组织。在根尖周疾病中，TGF-β能对抗促炎症因子IL-1和TNF-α，是巨噬细胞的灭活剂。研究结果对于阐明TGF-β阳性MCs在根尖周病的发病机制，尤其在根尖周囊肿中的作用具有理论意义和临床指导价值。控制TGF-β阳性的MCs或调节MCs的功能可能成为阻止根尖周病发展的一个治疗目标。从而，为根尖周病的治疗提供新的靶点，为临床治疗根尖周病提供更有效的治疗方向。

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Expression of transforming growth factor-β on mast cells in human chronic periapical diseases

YIN Xiao-ping1，CHEN Ke2，XIE Jin-qiang1，HUANG Shi-guang1
(1Faculty of Dentistry，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China;2Department of Stomatology，Guangzhou Women and Children Medical Centre，Guangzhou 510623，China.E-mail: thshg@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the distribution of mast cells ( MCs) and the expression of transforming growth factor-β( TGF-β) on tryptase positive MCs in different types of human periapical diseases.METHODS: Total 78 cases of specimens were involved in this study，including healthy control，periapical cyst and periapical granuloma.The tissue samples were fixed in 10% formalin for at least 48 h，stained with hematoxylin and eosin for histopathological examination，stained with toluidine blue staining for identifying MCs and MCs degranulation，and stained with double immunofluorescence for identification of tryptase-TGF-β double positive MCs.RESULTS: The density of tryptase-TGF-β double positive MCs in the periapical lesions was significantly higher than that in the healthy controls ( P＜0. 01).The number of TGF-β positive MCs in the periapical cyst was significantly higher than that in the periapical granuloma ( P＜0. 01).Compared with toluidine blue staining，the number of MCs with double immunofluorescence staining significantly increased ( P＜0. 01).CONCLUSION: The TGF-β positive MCs may play an important role in the pathogenesis of human chronic periapical diseases，particularly in the formation of fibrous tissue in periapical cyst.Double immunofluorescence staining is more sensitive than the traditional toluidine blue staining for identifying MCs.

［KEY WORDS］Chronic periapical diseases; Mast cells; Tryptase; Transforming growth factor-β

通讯作者△Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126. com

*［基金项目］广东省社会发展领域科技计划( No. 2013B021800043)

［收稿日期］2015-01-16［修回日期］2015-03-25

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1247-06

［中图分类号］R781. 34; R392. 3

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.017