张东涛 黄伟哲 陈喜珊

·实验研究·

丹参水提物对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用

张东涛 黄伟哲 陈喜珊

本文研究丹参水提物对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用。以乳鼠心室肌进行心肌细胞培养并建立缺氧-复氧损伤模型， 检测不同浓度丹参水提物预处理后细胞的存活率， 乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、天冬氨酸转移酶（AST）的泄漏量及Akt的磷酸化水平。丹参水提物对缺氧-复氧损伤的心肌细胞具有明显的保护作用， 这可能与它激活PI3K/Akt信号通路有关。

缺氧-复氧；心肌细胞；丹参水提物

丹参是著名的传统中药， 具有抗氧化、改善微循环防止血栓形成等多种功能， 近年来又发现丹参可促进骨愈合［1］、预防股骨头坏死［2］、有效降低绝经期妇女骨质疏松血中骨吸收生物指标［3］。但是丹参水提物对缺氧-复氧乳大鼠心肌细胞是否有保护作用研究不多， 本研究旨在采用缺氧-复氧乳大鼠心肌细胞损伤模型， 探讨丹参水提物对缺氧-复氧心肌细胞保护作用及可能的作用机制， 为其在临床上防治心肌缺血、缺氧性疾病提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 丹参水提物在试验室自制。

1.2 乳鼠心肌细胞培养 取出生1～3 d的 SD大鼠心肌组织，按文献［4］进行分次水浴搅拌消化， 差速贴壁法纯化心肌细胞， 以1×106/cm2的细胞密度接种于35 mm2培养皿。

1.3 心肌细胞缺氧-复氧模型的建立和分组 不含血清的DMEM低糖培养基， 纯氮1 L/min流量充分饱和30 min， 用上述培养基置换正常培养基， 将细胞放入密封袋充入高纯度氮气， 密封放入培养箱培养为缺氧；用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液置换培养基， 置于95%O2+5%CO2， 培养箱常氧培养为复氧。

细胞分为五组：正常组；缺氧-复氧模型组；丹参水提物组［分别在培养基中加入丹参水提物（0.2或0.4 g/L）， 其余操作同缺氧-复氧模型组］；LY294002组［在培养基中加入LY294002（30 μmol/L）， 其余操作同缺氧-复氧模型组］。

1.4 LDH、CK和AST活力测定 LDH、CK和AST活力用试剂盒测定。

1.5 Akt和p-Akt蛋白表达采用Biorad 法取总蛋白20 μg进行电泳分离蛋白。蛋白转印到硝酸纤维素膜， 3%BSA 液 4℃封闭过夜， 分别加入Akt和p-Akt单克隆抗体（1∶150稀释），4℃孵育过夜， 辣根过氧化物酶山羊抗兔 lgG 二抗孵育1 h，DAB 显色照相。用 image J 软件分析条带的积分光密度值，相对蛋白含量用积分光密度值表示。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 实施t检验；计数资料以率（%）表示， 实施χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 与正常组比较， 模型组中心肌细胞的存活率显著较低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与缺氧-复氧模型组比较， 丹参水提物（0.2或0.4 g/L）组心肌细胞的存活率显著较高，差异有统计学意义（P＜0.01）；同样的， 与模型对照组比较，LY294002（30 μmol/L）能够减弱丹参水提物提高心肌细胞的存活的效果， 差异有统计学意义（P＜0.01）， 见表1。

2.2 与正常组比较， 模型组中心肌细胞中的LDH、CK和AST活力显著增加， 差异有统计学意义（P＜0.01）；与缺氧-复氧模型组比较， 丹参水提物（0.2或0.4 g/L）组心肌细胞中的LDH、CK和AST活力显著降低， 差异有统计学意义（P＜0.01）；同样的， 与模型对照组比较， LY294002（30 μmol/L）预处理能够减弱丹参水提物对心肌细胞中的LDH、CK和AST活力降低的效果， 差异有统计学意义（P＜0.01）， 见表2。

2.3 与正常组比较， 模型组心肌细胞中的p-Akt蛋白表达水平显著较低， 差异有统计学意义（P＜0.01）；与缺氧-复氧模型组比较， 丹参水提物（0.2或0.4 g/L）预处理均能显著增加心肌细胞中的p-Akt蛋白表达水平， 差异有统计学意义（P＜0.01）。与丹参水提物（0.4 g/L）+缺氧-复氧组比较，LY294002（30 μmol/L）能够降低丹参水提物对p-Akt蛋白的激活效果， 差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表1 丹参水提物对心肌细胞的存活率的影响（ x-±s， %）

表2 丹参水提物对LDH、CK和AST活力的影响（ x-±s）

表3 丹参水提物对AI和p-Akt水平的影响（ x-±s）

3 讨论

目前缺血性心脏病的治疗方法主要是进行心肌再灌注，以改善心肌的血流量， 对缺血心肌的早期再灌注治疗是有益和必不可少的， 可以减轻缺血损伤， 挽救心肌细胞， 缩小梗死面积［4，5］。因此， 在复氧期给予抗凋亡干预可能有助于减少复氧所诱导的细胞损伤。

利用培养原代心肌细胞， 建立缺氧-复氧模型， 以心肌细胞培养基中LDH、CK、AST漏出量作为心肌细胞损伤的指标。LDH、CK、AST是心肌细胞胞内酶， 漏出量的多少能反映细胞膜的受损程度［6］。实验结果提示， 缺氧-复氧可以引起心肌细胞中LDH、CK、AST水平明显增加， 导致心肌细胞存活率下降， 丹参水提物（0.2或0.4 g/L）和LY294002（30 μmol/L）预处理均能显著降低心肌细胞中的LDH、CK、AST水平， 提高心肌细胞存活率。

Akt磷酸化可以抑制心肌细胞的坏死和凋亡， 保护心肌细胞， 对缺血性心脏病的治疗具有重要意义［7］， 本研究进一步考察了丹参水提物对缺氧复氧损伤所致的心肌细胞Akt磷酸化的影响， 结果表明丹参水提物可显著增加心肌细胞缺氧复氧损伤所致的 p-Akt蛋白表达， 这一效果可因Akt抑制剂LY294002的加入来减弱。

综上所述， 认为丹参水提物可以通过激活Akt的磷酸化，从而保护心肌缺血再灌注过程中心肌细胞的损伤。

［1］ 肇毅， 潘立群.丹参促进创伤修复机制的研究现状.南京中医药大学学报， 2000， 16（4）:253-254.

［2］ 史风雷， 任丽霞， 孙升云， 等.复方丹参注射液预防激素股骨头坏死的初步研究.中医正骨， 2002， 14（4）:3-5.

［3］ 李隆敏， 周樱， 邵幸署， 等.丹参酮防治绝经后骨质疏松.中国骨质疏松杂志， 1996， 2（1）:78-80.

［4］ Jen-HweyChiu， Ya-Fang Cheng， Jir-YouWang， et al.Remotepharmacological preconditioning on median nerve territory increases Hsp32 expression and attenuates ischemia-reperfusion injury in rat heart.Life Sciences， 2012， 90（17-18）:629-639.

［5］ Jianbo Gao， Yi Kang， Jianshi Lou.The Optimal Strategy of Noninvasive Limb Ischemic Preconditioning for Protecting Heart Against Ischemia-Reperfusion Injury in Rats.Journal of Surgical Research， 2012， 174（2）:47-54.

［6］ Jing Guo， Shou-Bao Wang， Tian-Yi Yuan， et al.Coptisine protects rat heart against myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing myocardial apoptosis and inflammation.Atherosclerosis，2013， 231（2）:384-391.

［7］ Krisztina Kovacs， Ambrus Toth， Peter Deres， et al.Critical role of PI3-kinase/Akt activation in the PARP inhibitor induced heart function recovery during ischemia-reperfusion.Biochemical Pharmacology，2006， 71（4）:441-452.

Protective effect by Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for hypoxia-reoxygenation damage in myocardial cells of suckling mice

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.
Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

To study the protective effect by Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for hypoxia-reoxygenation damage in myocardial cells of suckling mice.The hypoxia-reoxygenation damage model was made from myocardial cells culture of suckling mice.Detection was taken on cells survival rate， leakage rates of lactate dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， aspartate transaminase （AST）， and phosphorylation level of Akt of cells in different concentrations of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract.Salvia Miltiorrhiza aqueous extract provides obviously protective effect for myocardial cells with hypoxia-reoxygenation damage， and that may be related with its activation of PI3K/Akt signal path.

Hypoxia-reoxygenation; Myocardial cells; Salvia miltiorrhiza aqueous extract

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.07.207

2014-11-05］

515041 汕头大学医学院第一附属医院心血管内科（张东涛）， 心胸外科（黄伟哲）；汕头大学医学院第二附属医院心血管外科（陈喜珊）