李彦涵,余柄廷,孙 静,李建芳,乌美妮,王海璇,胡云章,胡凝珠

（1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心，昆明 650118；2.河北大学生命科学学院，河北保定 071000）

以RBP-4为靶点的疫苗对2型糖尿病小鼠血糖降低的研究

李彦涵1,余柄廷2,孙 静1,李建芳1,乌美妮1,王海璇1,胡云章1,胡凝珠1

（1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心，昆明 650118；2.河北大学生命科学学院，河北保定 071000）

目的 探讨以人源RBP-4为靶标的疫苗免疫干预胰岛素抵抗的有效性和可行性，为2型糖尿病治疗新方法的推进提供基础研究数据。方法 以T7噬菌体为载体表达人源RBP-4的疫苗经皮下免疫2型糖尿病小鼠，同时设空载体组和空白对照组，经2次免疫后在不同时间点检测体液免疫水平、空腹血糖值及体重，并于20周处死动物进行病理学切片检测。结果 RBP-4疫苗有效诱导了抗RBP-4 IgG抗体的产生，并于12周达到峰值，同时，免疫组的空腹血糖值从第8周开始逐步下降，到第12周时较空载体组和空白组有显著差异，并始终维持在2型糖尿病发病值（7 mmol/L）以下。实验期间，2型糖尿病小鼠未出现蜷缩、竖毛、搔鼻、抽搐等明显异常，免疫组、空载体组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均未观察到明显病变，表明RBP-4疫苗安全性良好。结论 RBP-4疫苗能显著降低2型糖尿病小鼠的血糖，有可能成为治疗胰岛素抵抗的一个新突破点。

2型糖尿病；RBP-4疫苗；db/db小鼠

目前，我国糖尿病发病人数达9840万，预计到2035年糖尿病的发病比例将达到13％［1]，随着病程进展2型糖尿病患者将出现许多严重并发症，严重影响生活质量甚至死亡。在目前药物治疗尚不能治愈2型糖尿病［2]，并且长期服药将带来巨大经济负担的情况下，另辟途径寻找新的预防和治疗方法具有重要意义。

由脂肪组织分泌的脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白-4（retinol binding protein，RBP-4）是肥胖症和胰岛素抵抗之间的关联因子［3]。在对胰岛素不敏感性增加的小鼠及患有肥胖症、2型糖尿病的患者体内，其血清中RBP4的含量明显增加［4]。血清中RBP-4含量的增加，会刺激肝脏表达葡糖异生酶—烯醇丙酮酸磷酸羧激酶，并削弱肌肉组织中的胰岛素信号传导途径［5]。通过转基因技术过表达人源RBP-4或将重组RBP-4注射到正常小鼠体内，可以引起机体对胰岛素的抵抗；相反，将RBP-4基因敲除后机体对胰岛素的敏感性增加。因此，RBP-4是一种源于脂肪细胞的“信号”，降低RBP-4的水平可能成为治疗2型糖尿病的一个新的途径［6-8]。

本实验将展示有人源全长RBP-4序列的以T7噬菌体为载体的疫苗与铝佐剂混合后免疫2型糖尿病db/db小鼠模型，观察糖尿病小鼠免疫后体液免疫效果以及体重、血糖等指标以及病理切片的变化，为以RBP-4为靶标的疫苗治疗2型糖尿病的研究提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 抗原

将人源全长RBP-4序列与经酶切处理的T7噬菌体基因组连接并展示于T7噬菌体表面作为免疫用的疫苗。该疫苗由中国医学科学院医学生物学研究所疫苗研究室提供，噬菌体效价（1.5×1010pfu/mL）。

1.2 实验试剂

稳豪血糖仪和血糖试纸购自强生（中国）医疗器材有限公司；Al（OH）3佐剂（29.9mg/mL）由中国医学科学院医学生物学研究所提供；ELISA试剂盒（AntiMouse ABT System）购自美国KPL公司。

1.3 实验动物

B6.BKS（D）-Leprdb/JNjuⅡ型糖尿病小鼠（db/db小鼠）模型购自南京大学模式动物研究所【SCXK （苏）2015-0001】，6～8周龄，体重30～35g。实验动物使用许可证号【SYXK（滇）2013-0001】。

1.4 动物分组及免疫

将30只Ⅱ型糖尿病小鼠（禁食后空腹血糖均≥10mmol/L）随机分为3组：免疫组（RBP-4疫苗1.5×108pfu+Al（OH）30.6 mg/只）、空载体组（T7空载体1.5×108pfu+Al（OH）30.6 mg/只）、空白对照组（生理盐水），每组各10只，免疫剂量为100 uL，检测体液免疫效果及体重、血糖指标变化。

1.5 血清中抗-RBP-4抗原特异性IgG抗体水平的检测

于免疫后的4、8、12、16、20周采集尾静脉血，分离血清，用RBP-4作为抗原包被板子，用间接ELISA法检测抗RBP-4抗体。取RBP-4抗原，加入96孔板中，100μL/孔，4℃包被过夜；以BSA 37℃封闭1 h；洗板4次，加入倍比稀释的小鼠血清（起始稀释倍数为1：40），100μL/孔，37℃孵育1 h；洗板4次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1：400稀释），100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板3次，加入TMB显色液，100μL/孔，显色5 min；加入2 mol/L H2SO4，100μL/孔，终止反应。于酶标仪405和655 nm波长处，检测各孔A值，以阳性反应的最大稀释度作为样品的抗体效价，根据ELISA结果计算各组的平均滴度。

1.6 体重及空腹血糖检测

实验期间，于免疫前及免疫后的4、8、12、16、20周检测实验动物血糖及体重指标的变化。过夜禁食、禁水、撤垫料，禁食12 h后，测体重及空腹血糖。

1.7 安全性实验

实验期间，观察并记录小鼠的饮食、体重、毛色、注射部位有无异常。免疫20周后，取RBP-4免疫组、空载体组及空白对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织，制备病理切片，HE染色，显微镜下观察。

1.8 统计学分析

应用SPSS软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清中抗RBP-4疫苗IgG抗体水平

间接 ELISA检测结果显示，RBP-4疫苗免疫db/db小鼠后，诱导了抗RBP-4抗体的产生，并且抗体水平在第二次免疫后的第12周时升至最高，并于之后开始逐渐下降。

表1 2型糖尿病小鼠抗RBP-4疫苗IgG水平Tab.1 The anti-RBP-4 IgG levels of type 2 diabetemice

图1 免疫后不同时间点免疫组小鼠抗RBP-4疫苗IgG水平

2.2 各组小鼠空腹血糖水平

各组小鼠于免疫前及二次免疫后的4、8、12、16、20周测空腹血糖。检测结果显示，空载体组和空白对照组在整个实验期间血糖值均大于 7.0 mmol/L，免疫组在免疫后的第8周血糖值下降，从第12周开始血糖值较空载体组和空白对照组差异显著（P ＜0.01），具有统计学意义。实验结果表明RBP-4疫苗免疫2型糖尿病小鼠后，对小鼠产生了保护作用，避免血糖水平升高，并且从12周以后小鼠血糖值均处于发病值（7.0 mmol/L）以下，说明RBP-4疫苗具有良好的降血糖的作用。

2.3 各组小鼠体重水平

各组小鼠于免疫前及二次免疫后的4、8、12、16、20周测体重。检测结果显示，在整个实验期间，免疫组较空载体组及空白组体重不具有显著差异（P＞0.5），说明RBP-4疫苗对体重无影响。

图2 免疫前及免疫后不同时间点各组小鼠空腹血糖值（单位：mmol/L）

图3 免疫前及免疫后不同时间点各组小鼠体重水平（单位：g）

2.4 安全性检测

实验期间各组小鼠体重、毛色均正常，未出现蜷缩、竖毛、搔鼻、抽搐、痉挛、水肿及休克等异常反应，各组小鼠注射部位均未出现红肿、结节。显微镜下观察显示，免疫组、空载体组及空白对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均未观察到病变，表明RBP-4安全性良好，病理切片图片见彩插6图4。

3 讨论

慢性非传染性疾病是全球一个严重的公共卫生问题，已成为影响人民健康的主要危害。

糖尿病已成为继肿瘤和心脑血管病之后的第三大非传染病，是导致病残和死亡的第三大原因。根据最新文献报道，2013年全球已确诊的糖尿病患者约3.82亿，预计到2035年将增长至5.92亿，其中在发展中国家糖尿病患者的数目将显著增加［1]。

2型糖尿病是指由于胰岛素抵抗伴胰岛素分泌不足所致的持续性慢性高血糖，占糖尿病总数的90％以上。2型糖尿病为终身疾病，可出现多种并发症，给患者、家庭以及社会带来沉重的负担。治疗2型糖尿病的主要药物有磺酰脲类、双胍类降血糖药、α葡萄糖苷酶抑制剂和胰岛素增敏剂［9-10]。但是采用2型糖尿病药物治疗具有以下不可避免的缺点：1.只能从一定程度上控制血糖；2.药物价格昂贵，导致治疗成本高；3.长期服用药物有一定的副作用；4.需要长期服药，给患者带来极大的不便。

RBP-4是一种转运蛋白，其主要功能是在血液循环中转运视黄醇。正常情况下，血清RBP4主要来源于肝细胞，其次为脂肪组织。新近发现，由脂肪组织分泌的RBP4是肥胖症和胰岛素抵抗之间的关联因子。在正常个体中，胰岛素与分布于细胞膜上的相应胰岛素受体结合后，刺激GLUNT4通路将葡萄糖转运到肌肉组织和脂肪细胞中，并抑制肝脏生成葡萄糖，由此维持血糖处于正常水平。Yang等［11]发现，在肥胖动物的脂肪组织中，GLUT4的表达量降低，伴随的是脂肪细胞分泌的RBP4表达量和分泌量的增加。这种分泌因子可能与视黄醇一起作用削弱肌肉组织中胰岛素信号通路，阻遏葡萄糖的转运，并干扰胰岛素对肝脏中葡萄糖生成的抑制作用，最终导致血糖升高。因此RBP-4作为一种新的脂肪源性信号，为胰岛素抵抗和2型糖尿病的干预治疗提供了新靶标。

本实验用展示于T7噬菌体表面的人源RBP-4疫苗免疫2型糖尿病模型小鼠db/db，于2次免疫后的各个时间点检测db/db小鼠的体液免疫效果、体重、血糖指标，免疫后第20周处死动物，检测病理切片。实验结果表明，RBP-4疫苗免疫小鼠后，诱导了抗RBP-4抗体的产生，并于12周达到峰值。同时，免疫组小鼠的空腹血糖值从2次免疫后的8周开始逐渐下降，在12周时与空载体组及空白组空腹血糖相比较具有显著差异，并在12周之后免疫组小鼠的空腹血糖值均低于2型糖尿病发病值（7 mmol/L），而空载体组和空白组小鼠在整个实验间期空腹血糖值均高于2型糖尿病发病值（7 mmol/L）。因此实验结果表明，RBP-4复疫苗免疫2型糖尿病小鼠后有效的诱导了抗RBP-4抗体的产生，中和了小鼠血液中的RBP-4表达量，使胰岛素对肝脏中葡萄糖生成的抑制作用恢复正常，最终血糖达到正常值，对2型糖尿病小鼠起到了有效的保护作用。病理切片结果显示，免疫组小鼠各主要组织无明显异常，安全性良好。但RBP-4疫苗对2型糖尿病小鼠的体重无干预作用，推测RBP-4虽然与糖代谢、脂代谢紧密相关，但在2型糖尿病干预过程中不涉及体重的降低。本实验结果表明，将RBP-4作为2型糖尿病免疫干预的新靶标，有可能成为治疗胰岛素抵抗的一个新突破点。

［1] Guariguata L，Whiting DR，Hambleton I，etal.Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035［J].Diabetes Res Clin Prac，2014，103：137-149.

［2] 常向云，糖尿病流行现状及防治对策［J]，全科医学临床与教育，2004，2（1）：49-50.

［3] Shaker O，El-Shehaby A，Zakaria A，et al.Plasma visfatin and retinol binding protein-4 levels in patients with type 2 diabetes mellitus and their relationship to adiposity and fatty liver［J].Clin Biochem，2011，44（17/18）：1457-1463.

［4] Tan Y，Sun LQ，Kamal MA，et al.Suppression of retinol-binding protein 4 with RNA oligonucleotide preventshigh-fat diet-induced metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease in mice［J].Biochim Biophys Acta，2011，1811（12）：1045-1053.

［5] Wang MN，Han YB，Li Q，et al.Higher serum retinol binding protein 4 may be a predictor ofweakmetabolic control in chinese patientswith type 2 diabetesmellitus［J].J Int Med Res，2012，40（4）：1317-1324.

［6] Berry DC，Noy N.Signaling by vitamin A and retinol-binding protein in regulation of insulin responses and lipid homeostasis［J].Biochim Biophys Acta，2012，1821（1）：168-176.

［7] Rocha M，Banuls C，Bellod L，et al.Association of serum retinol binding protein 4 with atherogenic dyslipidemia in morbid obese patients［J].Plos One，2013，8（11）：e78670.

［8] Norseen J，Hosooka T，Hammarstedt A，et al.Retinol-binding protein 4 inhibits insulin signaling in adipocytes by inducing proinflammatory cytokines in macrophages through a c-Jun N-terminal kinase-and toll-like receptor 4-dependent and retinolindependentmechanism［J].Mol Cell Biol，2012，32（10）：2010-2019.

［9] 张安玉，糖尿病流行趋势及其防治的有关问题，中国慢性病预防与控制，2005，13（6）：257-259.

［10] 任丽，2型糖尿病口服药物进展［J].辽宁医学杂志，2006，20 （4）：247-248.

［11] Qin Yang.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes，Nature，2005，436：356 -3.

The research of RBP-4 vaccine reducing blood glucose of type 2 diabetem ice

LIYan-han1，YU Bing-ting2，SUN Jing1，LI Jian-fang1，WU Mei-ni1，WANG Hai-xuan1，
HU Yun-zhang1，HU Ning-zhu1
（1.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research＆Development on Severe Infectious Diseases，Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases，Kunming 650118，China；
2.Life Science College of Hebei University，Hebei Baoding 071000，China）

Objective To explore efficacy of the human RBP-4 vaccine interventions targeting insulin resistance，and provide new ways to treatment of type 2 diabetes.M ethods T7 bacteriophage vector expressing human-derived vaccine RBP-4 subcutaneously immunized mice with type 2 diabetes，at the same time set up empty vector group and control group.After the second immunization，detecting humoral immunity levels，fasting plasma glucose value and weight at different time points，and the animalswere sacrificed for pathological slice assay at20 weeks.Results The anti-RBP-4IgG antibodies induced by RBP-4 vaccine was peaked at 12 weeks，the fasting blood glucose level of immunity group gradual decline from the 8th week to 12 weeks and compared with empty vector group and the control group were significantly different，and always maintain the value（7 mmol/L）or less.During the experiment，mice with type 2 diabetes did not appear straight，vertical hair，scratching nose，convulsions and other obvious abnormalities.The mouse heart，liver，spleen，lung and kidney lesions of Immunization group and vector group have no obviously pathological changes，indicating RBP-4 vaccine safety is good.Conclusion RBP-4 vaccine can significantly reduce fasting blood glucose level in type 2 diabeticmice，itmay become a new method in the treatment of insulin resistance.

Type 2 diabetes；RBP-4 vaccine；db/dbmouse

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0046-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.011

2013年云南省高技术产业发展项目计划：基因工程药物关键技术研究及新产品开发应用；云南省社会发展新药专项（2013BC011）；北京协和医学院协和青年基金（33320140080）。

李彦涵（1982-），女，助理研究员，研究方向：疫苗研发。E-mail：110393273@qq.com。

胡凝珠（1961-），女，主任技师，研究方向：疫苗研发。E-mail：845653517@qq.com。

﹞2015-08-31