陈周伟,朱丽敏,朱 聪,张思泉,符遥杰,沈建宇,郭江峰,丁先锋

(1.浙江理工大学生命科学学院,杭州 310018; 2.浙江天科高新技术发展有限公司,杭州 310012;3.杭州市西溪医院,杭州 310023)

乙肝病毒编码miRNA的预测及鉴定

陈周伟1,朱丽敏1,朱 聪2,张思泉3,符遥杰1,沈建宇1,郭江峰1,丁先锋1

(1.浙江理工大学生命科学学院,杭州 310018; 2.浙江天科高新技术发展有限公司,杭州 310012;3.杭州市西溪医院,杭州 310023)

为探究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是否能够编码microRNA(miRNA),与宿主mRNA靶向结合来参与病毒感染的调控机制,实验通过Vir-Mir数据库预测乙肝病毒编码的pre-miRNA,并结合miRNA测序和实时荧光定量PCR方法验证成熟体miRNA。结果显示:乙肝病毒DNA阳性的肝癌血清样本中存在六条pre-miRNA,并成功验证其中一条成熟体命名为hbv-miR-15467,为肝病治疗提供新的思路。

乙型肝炎病毒; miRNA; 预测

0 引 言

MicroRNAs是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性的,长度约为22 nt的非编码RNA。病毒miRNA产生过程类似于宿主细胞miRNA,成熟的miRNA大小和结构也与其他生物的miRNA类似[1],miRNA在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ作用下进行核内转录,经过加工形成初级转录产物pri-miRNA,随后经核糖核酸内切酶Ⅲ(Drosha)剪切形成pre-miRNA,这些pre-miRNA依赖于运输蛋白Exponin-5从细胞核转运到细胞质,由另一类核糖核酸内切酶Ⅲ(Dicer)切除其茎环结构,最终形成了成熟的miRNA[2]。miRNA能作用于靶基因mRNA 3′-UTR区,以干扰mRNA翻译的方式来负向调控基因的表达。miRNAs作为基因分子领域的研究热点,已有实验证实miRNA参与多种病毒性疾病,可通过影响病毒的复制、宿主免疫应答来改变病毒复制能力[3]。Sam等[4]研究发现病毒也能编码部分miRNA,目前已有超过250条病毒来源的miRNA得到证实[5],病毒miRNAs已经成为新的研究热点。

乙肝病毒相关性疾病包括由乙肝病毒引起的病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等,严重威胁着人类的健康。我国约有1.2亿乙肝病毒携带者,约占我国总人口的9.8%,慢性乙肝和肝硬化患者有3000万之多,乙型肝炎发展为肝硬化和肝癌的风险非常高,每年因肝硬化和肝癌死亡人数也超过30万[6]。HBV是一种部分环化的双链DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科,基因组长约3.2 kb[7]。病毒DNA的长链为负链,较短链为正链,两链DNA的5′端有长达250～300个互补的碱基,通过碱基配对构成环状DNA结构。HBV感染宿主后,宿主本身miRNA对病毒起作用,同时病毒编码的miRNA也可以作用于宿主基因[8]。本实验通过预测HBV基因组编码的miRNA分子,寻找到新的miRNA并预测其靶基因,探究HBV病毒与宿主之间miRNA的调控机制,以助于阐释HBV相关肝病发生发展中的致病机理。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验所使用的肝癌患者血清和健康人血清样本均来自杭州西溪医院,肝癌血清样本来自20例未接受任何治疗的肝癌患者,包括12例HBV DNA阳性患者和8例阴性患者,健康人血清样本来自10例体检志愿者。miRNeasy Serum/Plasma Kit购自Qiagen公司,PCR引物由上海生工公司合成,逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒miRNA预测

利用Vir-Mir数据库(http://alk.ibms.sinica.edu.tw/cgi-bin/miRNA/miRNA.cgi)预测HBV基因组编码的pre-miRNA,通过Genebank检索HBV全基因序列(序列号为NC_003977)。Vir-Mir数据库提供预测的病毒miRNA的候选发夹结构序列设定参数条件为:GC含量38%～65%;核心最小自由能37.5～19.5;发夹结构最小自由能50.9～28.2,得分在50分以上[9]。

1.2.2 样本制备

收集5 mL全血置于血清收集管;温和颠倒收集管5～8次;常温下静置30 min;然后将收集管置于离心机,4 300 r/min,常温离心10 min;将获得的上清转移至1.5 mL离心管;11 600 r/min,离心2 min;分离到的血清置于-80℃冰箱保存。按照miRNeasy Serum/Plasma Kit使用说明书,取200 μL血清提取总RNA,避免基因组DNA污染,洗脱得到50 μL的RNA溶液,置于-80℃冰箱备用。

1.2.3 候选pre-miRNA的初步验证

使用PCR方法对经Vir-Mir数据库筛选的候选前体分子进行初步验证,样本为HBV DNA阳性的肝癌患者血清与健康人血清。使用软件Primer Primier 5设计候选pre-miRNA的扩增引物,提取样本的总RNA,逆转录合成cDNA,通过PCR方法验证预测的前体分子是否存在。

1.2.4 成熟体miRNA的定位

利用二代测序方法对HBV DNA阳性肝癌患者的血清样本进行miRNA测序,测序结果得到的小分子片段与候选pre-miRNA序列进行比对,分析数据,对成熟体miRNA定位。设计候选成熟体miRNA的特异扩增引物,通过实时荧光定量PCR来验证其能否成为成熟体miRNA。

1.2.5 miRNA靶基因预测

首先使用RNAhybrid软件(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)预测HBV编码的miRNA作用于人类的潜在靶基因,设定参数条件为:螺旋限制在2～7个核苷酸;最小自由能比例在85%以上[10]。RNAhybrid是一种用于寻找一条长链RNA和一条短链RNA的最小配对自由能的工具,例如预测一条短链序列结合到长链的最佳位置上,适用于未命名的miRNA预测其靶基因位点。其次,通过MicroInspector软件(http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/)验证miRNA及其预测的靶基因是否存在结合可能性[11]。MicroInspector软件允许用户输入miRNA序列或序列片段,从不同的数据库中选择miRNA,同时也允许自定义miRNA和靶基因二聚体杂交温度和自由能等参数[12],适用于未知序列的靶基因预测。

2 结 果

2.1 HBV编码的miRNA前体分子的预测

将HBV基因序列号NC_003977输入Vir-Mir数据库,HBV基因组中共预测到6条候选miRNA前体分子,其中正向序列中有4条(15464、15465、15466和15467),反向序列中有2条(15468、15469)(表1)。上述6条序列经RNAstructure5.3软件分析,得到二级结构(图1),显示这6条候选序列均能形成典型的发夹结构,这提示HBV可能编码病毒来源的microRNA分子。

表1 HBV基因组中的候选miRNA前体分子

图1 候选miRNA前体分子的发夹结构

2.2 miRNA前体分子的初步验证

为了进一步验证6条候选pre-miRNA是否存在于肝癌患者血清,设计pre-miRNA的PCR引物(表2),通过PCR扩增目的片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳发现HBV DNA阳性肝癌血清样本中检测到目的片段,健康人血清未检测到(图2)。为进一步确定序列准确性,将目的片段割胶回收,使用TA克隆法与pMD18-T Vector连接,筛选与鉴定重组质粒,发现6条目的片段的Sanger测序结果与预测的候选前体序列基本匹配,存在1～4个碱基错配。这表明机体内含有大量乙肝病毒,复制比较活跃,传染性较强的HBV DNA阳性肝癌患者血清样本中的确存在预测的候选miRNA前体分子,HBV编码的miRNA与肝癌发生发展可能存在一定的联系。

表2 候选miRNA前体分子的PCR引物序列

注:F:Forward primer;R:Reverse primer。

图2 不同样本6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

2.3 成熟miRNA的定位

通过二代测序方法对HBV DNA阳性的肝癌血清样本进行miRNA测序,将测序结果得到的小分子片段与候选pre-miRNA序列进行比对后,发现有4条候选前体分子即15464—15467有比对结果,不同位置的候选成熟体有不同的reads数,结果见图3。笔者将选取reads数相对高,二级结构具有形成成熟miRNA潜力的序列(图3中截取部分),设计实时荧光定量PCR扩增引物,以肝癌血清总RNA为样本,进一步用实时荧光定量PCR方法验证。实验结果显示仅15467:ugccuuggguggcuuuggggca成熟miRNA的扩增曲线平滑且随着循环数的增加,荧光信号具有明显的对数扩增期,而空白对照无连续曲线生成,并且溶解曲线出现明显的单峰,说明扩增产物具有特异性(图4),因此验证了15467前体分子可剪切形成成熟miRNA,将该成熟体miRNA命名为hbv-miR-15467。

图3 不同位置的候选成熟体所占read比例

图4 hbv-miR-15467的扩增曲线与溶解曲线

2.4 miRNA的靶基因预测

使用RNAhybrid软件预测成熟体miRNA的靶基因,hbv-miR-15467预测到3个靶基因,包括软骨相关蛋白(CRTAP),细胞分裂周期相关因子1(FZR1)及转化生长因子(TGFB1)(表3)。此外,本实验还使用MicroInspector软件预测miRNA及其靶标的结合情况,靶基因的预测结果和RNAhybrid类似。这表明CRTAP、FZR1及TGFB1基因具有一定的验证价值,可能有助于探究HBV病毒与宿主之间进行的miRNA调控机制。

表3 成熟miRNA的靶标预测

3 讨 论

我国作为肝病大国,导致肝癌高发生率的一部分原因是由于乙肝病毒感染,超过8%的肝癌患者都遭受病毒感染[13],因此探究乙肝病毒的致病机理至关重要。抗病毒治疗无疑是阻止肝硬化进程及肝癌发生的重要途径,而目前的重组干扰素及核苷类似物等抗病毒治疗手段疗效不够满意[6]。HBV的复制及其致病的分子机制尚未完全阐明,本研究为病毒感染研究提供了新的思路。

MicroRNA作为普遍存在于动植物体内的一类内源性基因表达调控因子,在各种生理病理过程中发挥的重要作用使其迅速成为生命科学研究的前沿领域。病毒编码的miRNA的作用一般可分为三类:延长感染细胞的寿命;逃避免疫反应;调节宿主或病毒基因[5]。病毒可利用自身编码的miRNA与自身基因序列结合来逃避宿主免疫系统的监督和维持潜伏状态[14]。例如,孢疹病毒[15-16](Epstein Barr virus,EBV),卡波氏孢疹病毒[17](KSHV)和马立克氏病毒[18](MDV1)编码的病毒miRNA能够通过作用于宿主细胞的促凋亡因子来抑制细胞凋亡。由于病毒基因组较小且紧致,形成茎环结构的背景片段数量很小,因此尽管基于序列和结构特征打分的预测方法较为简单,但仍然在病毒miRNA预测中取得了较好的效果[19]。Vir-Mir是专门用于预测病毒编码miRNA的数据库,并已成功预测出5种病毒的64条已知前体miRNA[9]。目前约有26%的已知病毒miRNAs类似于宿主miRNA通过种子序列结合靶基因发挥调控作用[5]。因此,使用RNAhybrid软件预测hbv-miR-15467的靶标,并使用MicroInspector软件验证了miRNA及其潜在靶基因CRTAP、FZR1和TGFB1确实存在结合可能性。其中CRTAP为软骨相关蛋白,主要与成骨不全相关;FZR1为细胞分裂周期相关因子1,是细胞周期末期促进复合物的调节亚基,与胎盘发育相关,目前无资料显示CRTAP和FZR1与病毒感染或肝癌生成相关;而TGFB1是一个与肿瘤发生相关的重要因子,在组织再生、细胞分化,胚胎发育及免疫系统调节等生命活动中起重要作用[20]。本实验预测的病毒miRNA及其靶基因的相互作用还需通过一系列实验验证,可能为抗乙肝病毒治疗提供新的治疗靶点。

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(责任编辑：许惠儿)

Prediction and Identification of HBV-Encoded miRNA

CHENZhou-wei1,ZHULi-min1,ZHUCong2,ZHANGSi-quan3,FUYao-jie1,SHENJian-yu1,GUOJiang-feng1,DINGXian-feng1

(1.School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China; 2.Zhejiang Tianke High-Tech Development Co.,Ltd.,Hangzhou 310012,China; 3.Hangzhou Xixi Hospital,Hangzhou 310023,China)

To explore whether the hepatitis B virus (HBV) can encod microRNA (miRNA) and involve in regulation of virus infection by targeting the host mRNA,Vir-Mir database was used to predict HBV-encoded pre-miRNA.The mature miRNA was validated by miRNA sequencing and real-time fluorescence quantitative PCR method.The results show that six pre-miRNAs exist in lover cancer serum sample with positive HBV DNA level.A mature miRNA named hbv-miR-15467 was validated successfully.This paper provides new thoughts for liver cancer treatment.

hepatitis B virus; miRNA; prediction

1673-3851 (2015) 02-0253-05

2014-05-21

浙江省公益技术研究社会发展项目(2012C23072)

陈周伟(1988-),女,浙江温州人,硕士研究生,主要从事核酸方面的研究。

丁先锋,E-mail:bdd114@163.com

Q52

A