隋小宇,董晓泽,韩翠艳,袁 橙,刘 畅,马晓星,刘婷婷

(齐齐哈尔医学院药学院,黑龙江齐齐哈尔 161006)

辅酶Q10前体脂质体的制备及其质量评价

隋小宇,董晓泽,韩翠艳,袁 橙,刘 畅,马晓星,刘婷婷*

(齐齐哈尔医学院药学院,黑龙江齐齐哈尔 161006)

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采用高压均质结合冷冻干燥法制备辅酶Q10前体脂质体,并通过正交实验设计对处方及工艺进行优化。经红外光谱、X射线衍射等手段对优化后的产品质量进行分析,同时,对其稳定性进行评价。结果显示本研究制备的辅酶Q10前体脂质体经重建后的平均粒径为241 nm,包封率67.31%,贮存90 d后质量无明显变化。本实验制备的前体脂质体,质量可靠,稳定性好,工艺便捷,适于工业生产及食品中应用。

辅酶Q10,前体脂质体,冷冻干燥,正交设计

辅酶Q10(coenzyme Q10)是人体中一种内源性抗氧化剂,也是细胞代谢激活剂,其富含于心脏、肝脏和大脑中[1]。但是随着年龄的增长,人体合成辅酶Q10的能力逐渐降低[2],因此外源性辅酶Q10的补充很有必要,美国FDA在上世纪80年代就已批准辅酶Q10可作为膳食补充剂[3]。但由于辅酶Q10分子量较大,且在水中溶解度极低,因此口服吸收效率差[4]。

脂质体具有良好的生物相容性、可降解性及靶向性,并且克服了疏水性物质胃肠吸收差的问题,因此在食品和药品领域有着广阔的应用前景。但其贮存过程中具有易水解、聚集、分层、包封物渗漏等缺点,因此,对其应用产生了一定的限制[5]。

前体脂质体系脂质体的前体形式,通常为干燥且具有良好流动性能的粉末,在水中可自发形成完整的脂质体。它具有脂质体制剂的一系列作用特点,又可解决其易水解、聚集、分层、药物渗漏和高温灭菌不稳定等问题,这为脂质体在提高食品活性物的生物利用度和应用提供了一个有效的途径[6]。但前体脂质体商品化进程至今仍较缓慢,主要原因是前体脂质体的质量不易控制,尤其是重建后的粒径尺寸和包封率不稳定,而脂质体粒径的大小直接影响其在体内的吸收和分布,已有研究表明,脂质体粒径越小其靶向性越优良[7]。

目前,粉末状脂质体前体的制备主要有载体沉积法及将传统脂质体制备方法同冷冻干燥或喷雾干燥相结合的方法。但这些方法存在产品粒径大,粒径分布不均,载体受热不稳定,产品不易收集等缺点。基于此,本研究拟采用高压均质法(挤压法)结合冷冻干燥法制备辅酶Q10前体脂质体,并对其处方和工艺进行优化,以解决其重建后粒径较大及分布较宽的问题。同时,该方法避免了高温对主药及载体的影响,且产品易于收集。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

RE-52AA型旋转蒸发仪 上海青浦沪西仪器厂;Scientz-10N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;NS1001L 高压均质机 意大利 GEA Niro Soavi公司;Biofuge 22R型低温高速离心机 德国Heraeus公司;高效液相色谱仪(Waters 1525型进样泵+Waters 2489型紫外/可见检测器) 美国Waters公司;IRAffinity-1型红外光谱仪 日本岛津公司;Xpert-Pro型X射线衍射仪 荷兰Philips公司;BI-90Plus型激光粒度仪 美国Brookhaven公司;大豆卵磷脂S100(平均分子量734.83 g/mol)、蛋黄卵磷脂E80(平均分子量648.22 g·mol-1) 均购自德国LIPOID公司;胆固醇 上海艾韦特医药科技有限公司;辅酶Q10(≥98%) 购自陕西森弗生物技术有限公司;辅酶Q10对照品 购自美国Sigma公司;甲醇(色谱纯) 美国Merck公司;乙醇、丙酮、二氯甲烷均为分析纯;所有用水均为超纯水,自制。

1.2 实验方法

1.2.1 辅酶Q10前体脂质体的制备 精确称取配方量的辅酶Q10、卵磷脂、胆固醇溶解于5 mL有机溶剂,然后将该有机溶剂与一定体积比的PBS缓冲液(pH7.4)混合,使用温控磁力搅拌器于2000 r·min-1转速下搅拌一定时间(5、10、20 min)后形成乳化液。将该乳化液置于100 mL梨形烧瓶中减压旋转蒸发挥尽有机溶剂,得到脂质体混悬液。将此混悬液在一定压力(40、60、80 MPa)下高压均质挤压处理(6个循环),即制得较均匀的淡黄色的辅酶Q10脂质体悬浮液。最后将该悬浮液加入冻干保护剂,于-40 ℃冰箱中预冻3 h后,置于冷冻干燥机中干燥后即得到辅酶Q10前体脂质体。

1.2.2 卵磷脂及有机溶剂的选择 分别称取70 μmol所对应质量的大豆卵磷脂及蛋黄卵磷脂,并分别与35 μmol胆固醇及4.5 mg辅酶Q10共同溶解于5 mL二氯甲烷或氯仿中,与25 mL的PBS缓冲溶液混合,于35 ℃温度下搅拌5 min形成乳化液(搅拌速度为2000 r·min-1),然后于40 ℃下减压蒸发3 h除去有机相,脂质体混悬液于30 MPa下进行高压均质处理,最后将脂质体混悬液置于-40 ℃冰箱中预冻3 h后,放入冻干机中冷冻干燥处理后得到前体脂质体。将使用两种卵磷脂所制得的前体脂质体,分别在室温下水化重建40 min,比较脂质体重建液的包封率及平均粒径。

1.2.3 处方筛选 本研究以辅酶Q10包封率和重建脂质体的平均粒径为主要考察指标,保持工艺条件不变(乳化搅拌时间10 min,乳化温度35 ℃,减压蒸发温度40 ℃,减压蒸发时间3 h,旋转蒸发转速75～85 r·min-1,均质压力40 MPa,冻干保护剂甘露醇与卵磷脂质量比为1∶1)。通过预实验,选择了四种影响因素:磷脂与胆固醇的质量比(A)、卵磷脂用量(B)、磷脂与辅酶Q10的质量比(C)、有机相与水相的体积比(D),每个因素取三水平选用L9(34)正交表进行处方正交实验设计,实验因素与水平见表1。

表1 配方筛选正交设计因素水平表

1.2.4 制备工艺优化 本研究固定处方(卵磷脂用量100 mg,卵磷脂与胆固醇质量比4∶1,磷脂与辅酶Q10的质量比10∶1,有机相与水相之比为1∶4,冻干保护剂甘露醇与卵磷脂质量比为1∶1),根据预实验结果选择了三个主要因素:均质压力(A)、减压蒸发温度(B)、乳化搅拌时间(C),每个因素取三水平选用L9(34)正交表进行制备工艺正交实验设计,实验因素与水平见表2。

表2 优化制备工艺的正交设计因素水平表

1.2.5 冻干保护剂的选择 本实验中,称取960 mg大豆卵磷脂、240 mg胆固醇、96 mg辅酶Q10共同溶解于60 mL二氯甲烷中,然后与360 mL的PBS缓冲液于35 ℃下混合搅拌5 min,将此乳化液于45 ℃下减压蒸发3 h除去二氯甲烷,将该悬浮液高压均质(60 MPa)处理6个循环后分成等量若干份,分别加入不同质量的海藻糖、葡萄糖和甘露醇作为冻干保护剂,冷冻干燥后水化重建,检测包封率及平均粒径尺寸,对比其冻干保护效果。

1.2.6 重建脂质体溶液的沉降稳定性 取3批前体脂质体,用注射用水重建水合(2.5 mg·mL-1),将其置于4 ℃冰箱内,于每天同一时间观察其沉淀现象。

表3 不同卵磷脂及有机溶剂对产品包封率及平均粒径的影响

1.2.7 前体脂质体贮存稳定性的考察 取3批前体脂质体置于-20 ℃下贮存,并于不同时间点(0、30、60、90 d)取样,进行平均粒度及包封率的检测。

1.2.8 各项指标检测

1.2.8.1 粒径的测定 称取10 mg前体脂质体样品加入4 mL去离子水中,于室温(25 ℃左右)下水化重建40 min后,取3 mL加入比色皿,不加入表面活性剂,移入激光粒度分析仪样品池。检测温度设定为25 ℃。单次时间1.5 min,测定3次。

1.2.8.2 HPLC测定方法的建立 采用高效液相色谱法(HPLC)对辅酶Q10含量进行测定。色谱柱:Hypersil C18柱(φ4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:甲醇-乙醇(10∶90体积比);流速:1.0 mL·min-1;进样量:10 μL;检测波长:275 nm;柱温:25 ℃。

精确称取10 mg辅酶Q10标准品,用正己烷-乙醇混合溶剂(体积比1∶1)溶解定容至10 mL。然后分别移取100、250、500、1000、2500、5000 μL至10 mL容量瓶,用混合溶剂定容,配制成浓度为10、25、50、100、250、500 μg·mL-1的标准溶液。

以峰面积(y)和样品的质量浓度(x)为纵、横坐标进行线性回归,求得标准曲线方程:y=20439x-19689,R2=0.999,线性范围为10～500 μg/mL。方法的精密度、重现性的RSD值分别为0.28%和0.55%;回收率为98.85%,RSD值为0.98%,符合限度要求。

1.2.8.3 包封率的测定方法 在本研究中,采用反透析法测定脂质体包封率。移取前体脂质体重建液50 mL置于透析袋外,水合介质2 mL于透析袋内,搅拌透析袋外液,透析12 h。精密吸取透析袋内液,以2 mL正己烷萃取后,使用正己烷-乙醇(1∶1 v/v)混合溶剂定容至10 mL,并采用HPLC法测定其浓度,经换算后计算出50 mL重建液中游离药物含量。另取未透析的脂质体溶液5 mL,加入5 mL乙醇,超声处理5 min破乳后,再加入10 mL丙酮,涡旋震荡1 min,然后取10 mL置于离心机中以8000 r/min的转速离心10 min,取上清液采用HPLC法检测其中辅酶Q10的含量,经换算后计算出50 mL重建液中主药总含量。按下式计算包封率:

包封率(%)=[1-(游离辅酶Q10含量/辅酶Q10总含量)]×100

1.2.8.4 红外光谱分析 分别称取2～3 mg样品与200 mg溴化钾,使用玛瑙研钵研磨混合均匀后压片待测。红外光谱扫描范围为400～4000 cm-1。

1.2.8.5 X射线衍射分析 样品检测电压40 kV,电流30mA,扫描范围从3°到30°,扫描速率为1°·min-1。

2 结果与分析

2.1 有机溶剂及磷脂种类的确定

实验结果如表3所示。从包封率来看,当使用蛋黄卵磷脂,并且以氯仿为溶剂时,水合后的前体脂质体包封率最高,达到了60.82%。当使用大豆卵磷脂,并且使用氯仿为溶剂时,重建后的脂质体包封率最低,为31.59%。而同时使用大豆卵磷脂及二氯甲烷时,包封率为52.55%,与同时选择蛋黄卵磷脂及氯仿时,相差了8.27%。另一方面,对于制备过程来讲,当以二氯甲烷为溶剂时,由于二氯甲烷沸点比氯仿低,所以减压蒸发时只需控制较低的温度,溶剂即可快速挥尽,而氯仿则需要更高的温度和更长的时间才能彻底挥尽,从能耗和效率上考虑,二氯甲烷更加适宜。并且,从乳化的效果来看,二氯甲烷与PBS缓冲溶液的乳化效果优于氯仿,混合乳化更加容易且乳化液更加均匀,而氯仿与水的乳化效果一般。另外,从溶剂的安全性角度考虑,由于二氯甲烷为低毒溶剂,而氯仿为中等毒性溶剂,所以,使用二氯甲烷更为适宜。

从重建液平均粒径来看,无论是使用二氯甲烷还是氯仿,大豆卵磷脂体系重建液的平均粒径都要比蛋黄卵磷脂体系的粒径小。综合考虑粒径,包封率及安全性,最终选择使用大豆卵磷脂为膜材,二氯甲烷为溶解溶剂。

2.2 处方筛选正交实验结果

处方筛选的正交实验结果列于表4。在本研究中,采用双指标进行优化,由于未对两指标的权重系数进行评分,所以,为了尽量避免双指标在因素及水平筛选的过程中出现不一致,我们主要对具有显著影响(p<0.05)的因素进行水平优化,而其它无显著影响的因素(p>0.05),在选择水平时会适当考虑成本和能耗。对于包封率,由极差值对比可知,各因素影响大小次序为C>A>B>D,即脂药比>脂胆比>卵磷脂用量>有机相与水相体积比。为了进一步确认影响因素的显著性,进行方差分析,由于样本量较少,自由度不足,无法进行4因素的方差分析,所以,将极差分析中影响最小的D因素舍去,对其他因素进行正交的方差分析。结果表明,A、B、C三因素的p值分别为0.025、0.093和0.024,说明因素A及C对包封率的影响具有显著性(p<0.05)。对于因素A具有显著性的机理可能在于:胆固醇作为两亲性物质,可以起到表面活性剂的作用,能调节脂质体膜的流动性,增加药物与磷脂亲合性,防止药物的渗漏。胆固醇也能在脂质体表面形成一层电荷层,增加脂质体微粒间的斥力,避免脂质体融合,发挥稳定脂质体的作用[8-9],这也就有效提高了药物的包封率。对于平均粒径,极差分析结果显示四种因素的影响大小次序为C>A>B>D。同样舍去因素D进行方差分析,A、B、C三因素的p值分别为0.215、0.590和0.143,说明三种因素对粒径的影响均不显著。因此,首先将对于包封率具有显著影响的因素A和C进行水平选择,根据极值确定A1C2组合,其次考虑到因素B水平过低及因素D水平过高时,获得单位质量产品的冻干成本均将增加,所以选择B2及C2水平,最终组合为A1B2C2D2。在此条件制备的前体脂质体,其重建液的包封率为61.31%,平均粒径为286 nm。

表4 辅酶Q10前体脂质体配方筛选正交实验结果

2.3 制备工艺的正交实验结果

正交实验结果见表5。对于包封率,极差分析显示三种因素影响大小次序为B>A>C。通过进一步的方差分析可知,A、B、C三因素的p值分别为0.087、0.028和0.899,说明因素B对包封率具有显著影响,而其它两因素对包封率无显著影响。因素B具有显著影响可能是由于在有机溶剂的减压蒸发过程中,温度可以影响卵磷脂膜的流体性质,继而影响脂质体的构建效果和包封率。对于平均粒径,极差分析显示三种因素的影响大小次序为A>B>C。方差分析显示三因素的p值分别为0.048、0.140和0.250,可见均质压力对粒径有显著影响,而其它两因素对平均粒径无显著影响。因此,先将对于包封率有显著影响的因素B及对粒径具有显著影响的因素A进行水平选择,根据极值可知组合为A1B3。因素C(乳化时间)对包封率及粒径均无显著影响,考虑其水平越低越节约能耗,选择C1水平。所以,最终组合为A1B3C1,此条件下重建脂质体的包封率为67.31%,平均粒径为241 nm。

表5 辅酶Q10前体脂质体制备工艺正交实验设计及结果

2.4 冻干保护剂的选择

实验结果如表6所示,对于包封率,当以海藻糖为保护剂时,包封率相比于使用等量的其它两种保护剂时更高,而使用葡萄糖为保护剂时,包封率较差。并且,随着保护剂添加量的增加,包封率也逐渐变大,这说明冻干保护剂与卵磷脂发生作用,其保护效果决定于其与卵磷脂的比例[12]。对于水合后的平均粒径,使用海藻糖的重建脂质体的粒径尺寸明显小于使用等量其它两种保护剂时的尺寸,随着海藻糖的添加量由1∶1增加到1∶4,平均粒径由212 nm逐渐减小到189 nm。当使用其它两种保护剂时,平均粒径在202～276 nm之间。另一方面,与冻干前的脂质体粒径(176 nm)相比,使用海藻糖时,冻干后脂质体粒径的变化倍率范围为1.07～1.20倍,而不加入冻干保护剂时的变化倍率为2.0,这说明其对冻干前后粒径变化的控制效果良好。

图1为使用海藻糖作为保护剂时制备的辅酶Q10前体脂质体的外观。前体脂质体粉末颜色均匀,呈颗粒或碎片状,结构饱满,且没有干缩结团现象。这可能由于高浓度的糖溶液会诱导脂质体膜玻璃态的形成,一旦形成玻璃态,水分子的流动减小,溶液的黏度增加,使得脂质体膜链段运动受阻,分子的伸展和聚集受到抑制,从而保护其结构不会发生塌陷。前体脂质体经过30 min水化重建后,脂质体混悬液分散均匀,无颗粒团聚或沉降。

表6 不同冻干保护剂对产品包封率及平均粒径的影响

图1 使用海藻糖作为冻干保护剂时制备的辅酶Q10前体脂质体粉末及其重建液Fig.1 Proliposome of coenzyme Q10 and its reconstruction solution when trehalose was used as cryoprotectant 注：卵磷脂与海藻糖质量比1∶2。

2.5 前体脂质体的红外光谱分析

图2a～图2c分别为空白前体脂质体、辅酶Q10原料以及辅酶Q10前体脂质体的红外光谱谱图,在辅酶Q10原料药的红外光谱图中,1700～400 cm-1范围内出现了许多特征吸收峰,3000～2800 cm-1内也有一处较为明显的吸收。对于空白脂质体和载药前体脂质体,在4000～400 cm-1范围内,除了有两处峰强度稍有所减弱外,两者光谱图的吸收峰位置基本一致。并且,在辅酶Q10原料谱图中出现的特征吸收峰在载药脂质体的图谱中并未有呈现,这也许是由于主药已经被包裹在前体脂质体的囊腔之中。

图2 红外光谱谱图Fig.2 FT-IR spectrogram注:a空白脂质体;b辅酶Q10原料;c辅酶Q10前体脂质体。

2.6 XRD图谱分析

图3a～图3c分别为空白前体脂质体、辅酶Q10前体脂质体以及辅酶Q10原料药的X射线衍射谱图,从图可见,辅酶Q10原料在衍射角为18.8°以及22.9°时有两处较强的衍射峰,另有一些相对较弱的结晶衍射峰存在。而在空白脂质体以及载药前体脂质体的谱图中,衍射角为18.8°和22.9°处,并没有明显的衍射峰出现,只在27.4°处出现了一个小的衍射峰,而在辅酶Q10原料的图谱中,在这个角度时并无衍射峰出现,这可能是由于脂质体冻干前所加入的海藻糖引起的[13]。除了原料的主要两个衍射峰消失以外,在原料XRD谱图中存在的其他小峰也并未出现在载药前体脂质体的谱图中,而且,载药前体脂质体在3～30。范围内谱图较平稳,未出现明显的衍射峰。这可能是由于辅酶Q10已经被包藏在脂质体的囊腔之中,或者载药前体脂质体中的主药结构已经接近无定形状态。

2.7 重建脂质体溶液的沉降稳定性

3批产品分别于第4,4,5 d时有极少量沉淀产生。观察至第15 d时,沉淀无明显增多。可见,重建后的脂质体在3 d内能够保持稳定。

2.8 重建脂质体的贮存稳定性

将按优化配方和工艺制备的3批辅酶Q10前体脂质体贮存于-20 ℃环境下,定期将其水化后检测产品粒径及包封率。从表7可以看出,辅酶Q10前体脂质体具有较好的冷藏稳定性,贮藏90 d后平均粒径与包封率均无明显改变。前体脂质体粉末颜色未变,色泽均匀,无坍塌或干缩现象,且水化重建液无沉淀物产生。

表7 载药前体脂质体的贮存稳定性实验(x±s,n=3)

图3 X射线衍射谱图Fig.3 XRD spectrogram注:a：空白脂质体;b：辅酶Q10前体脂质体;c：辅酶Q10原料。

3 结论

在本研究中,采用高压均质结合冷冻干燥法制备辅酶Q10前体脂质体,最终选择磷脂与胆固醇的质量比4∶1,磷脂与辅酶Q10的质量比10∶1,高压均质压力40 MPa,减压蒸发温度45 ℃,乳化时间5 min,卵磷脂与海藻糖质量比1∶2。制得的前体脂质体水化重建后平均粒径为241 nm,包封率67.31%。红外光谱及X射线衍射分析表明,辅酶Q10已被包裹于脂质体囊腔之中,或部分主药呈无定形态。在本研究中并未使用表面活性剂,有研究表明加入适宜的表面活性剂能加快脂质体的封装速率,可有效控制脂质体的形状和粒径,从而稳定或提高包封率[14]。所以,对于所制备的辅酶Q10前体脂质体来说,如果想要进一步改进产品的各种性能和功能,可以尝试加入不同的表面活性剂来实现。

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Study on the preparation of coenzyme Q10precursor liposomes and its quality

SUI Xiao-yu,DONG Xiao-ze,HAN Cui-yan,YUAN Cheng,LIU Chang,MA Xiao-xing,LIU Ting-ting*

(College of Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China)

To prepare coenzyme Q10precursor liposomes using high pressure homogenization combine with freeze drying. Orthogonal experimental was performed for optimizing preparation process and formulations of precursor liposomes. The quality was investigated by infrared spectroscopy,x ray diffraction,etc. Meanwhile,the stability of product was investigated. In this study,average particle size of reconstruction solution of precursor liposome was 241 nm,and encapsulation efficiency was 67.31%. There were no significant changes of the quality after 90 days of storage. The precursor liposome prepared in this study had good quality and stability. Moreover,it is easy to manufacture and convenient for application in food.

coenzyme Q10;precursor liposomes;freeze drying;orthogonal design

2015-02-09

隋小宇(1980-)，男，博士，讲师，研究方向：药物传递系统，E-mail:suixiaoyu@outlook.com。

*通讯作者:刘婷婷(1984-)，女，博士，讲师，研究方向：药物色谱、光谱分析，E-mail:ltting@outlook.com。

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541918)。

TS218

A

1002-0306(2015)21-0127-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.018