杨馥语，屈 杰，李 龙，黄彦铭，谭万初

(成都中医药大学，四川 成都 610000)



蒿芩清胆汤对幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表达影响研究

杨馥语，屈 杰，李 龙，黄彦铭，谭万初*

(成都中医药大学，四川 成都 610000)

目的：观察蒿芩清胆汤对幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜核转录因子κB p65(NF-κBp6)、白细胞介素-8(IL-8)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响，探讨其治疗幽门螺杆菌相关性胃炎(HAG)的作用机制。方法：按照性别、体重随机抽取10只小鼠作为空白对照组，其余60只小鼠采用幽门螺杆菌(Hp)标准菌株(SS1)布氏肉汤液灌胃造模，建立Hp感染小鼠模型。造模成功后，将其随机分为6组，每组10只，分别为丽珠胃三联组、三九胃泰组、模型组、蒿芩清胆汤高、中、低剂量组，每组小鼠灌服相应药液，空白组、模型组小鼠灌服等量生理盐水，每天1次。2周后处死动物，观察各组小鼠胃黏膜病理改变，采用免疫组化法检测其胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表达情况。结果：与模型组比较，蒿芩清胆汤能显著降低小鼠胃黏膜炎症面积，降低胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：蒿芩清胆汤能减轻Hp感染小鼠胃黏膜炎症，其作用机制可能与抑制NF-κBp6炎症通路激活，下调IL-8、iNOS过度表达有关。

蒿芩清胆汤；幽门螺旋杆菌；诱导型一氧化氮合酶；白细胞介素8；核转录因子

现代研究表明，H.pylori(Hp)感染是慢性胃炎、消化性溃疡等多种常见胃肠道疾病的首要病因，且幽门螺杆菌相关性胃炎(HAG)是非贲门部胃腺癌的癌前期病变[1]，因此根除H.pylori已成为当前防治慢性胃病的重要方法和研究热点。Hp的耐药性以及药物的副作用等因素严重影响了Hp的根除。中医药治疗HAG具有症状缓解快、副作用小、不易产生耐药性等优势，具有较高的临床应用价值。蒿芩清胆汤出自清代名医俞根初的《重订通俗伤寒论》，原方主治少阳湿热痰浊证，具有清热利湿、利胆和胃的功效，现代临床多用于治疗功能性消化不良、胆汁反流性胃炎、结石性胆囊炎等消化系统疾病[2]。本实验通过建立Hp感染小鼠胃黏膜损伤模型，采用免疫组化法检测胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS的表达情况，探讨蒿芩清胆汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的作用机理，现报道如下。

1 材料与试剂

1.1 动物

C57BL/6小鼠70只，SPF级，8～9周龄，平均体重20～25g，雌雄各半，由成都中医药大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(川)2013-24。

1.2 试剂

磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9062)；NF-κBp6试剂(武汉博世德生物工程有限公司，批号：BA0610)；IL-8(北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0780R)；iNOS抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZS-651)；幽门螺杆菌采用SS1(Sydney strain 1)菌株，培养液由四川大学华西医学院提供。

1.3 仪器

2015型转轮式切片机(德国徕卡仪器有限公司)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威医疗仪器有限公司)；BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪实业集团有限公司)； Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)。

1.4 药物

蒿芩清胆汤(青蒿7g、黄芩10g、法半夏5g、竹茹10g、茯苓10g、陈皮5g、枳壳5g、滑石6g、青黛3g、生甘草1g)由成都中医药大学中药房提供。中药浸泡30min后用武火煎煮2次，再将汤汁熬成浸膏，高温灭菌后备用。丽珠胃三联(枸橼酸铋钾片/克拉霉素片/替硝唑片)，由丽珠集团丽珠制药厂生产。三九胃泰颗粒由三九医药股份有限公司生产。按照实验动物与人体体表面积比进行等效剂量换算，计算小鼠用药量。

2 方法

2.1 造模方法

[3]，将SS1冻存菌株经Skirrow’s选择性及非选择性培养基复苏，于37℃微需氧条件下(O25%、CO210%、N285%)培养72h，采用布氏汤收集细菌，并调整浓度为1.0×109CUF/mL备用。小鼠禁食不禁水24h后，除空白组外，其余小鼠均先用5%碳酸氢钠溶液0.2mL灌胃，30min后按照每次0.2mL/只的剂量，灌胃Hp菌液，连续4次，每次间隔48h。空白对照组小鼠予以等量生理盐水灌胃。于末次接种后第4周时禁食12h，处死小鼠，取3块胃窦组织，一块经石蜡包埋，切片后经W-S染色，进行病理组织学及Hp检测；一块进行快速尿素酶试验；另一块匀浆稀释后进行Hp培养，培养后将可疑菌落革兰染色具有典型特征且触酶试验、氧化酶实验以及尿素酶试验阳性者判定为Hp感染，其中有两项阳性者，即说明造模成功。

2.2 分组与给药

SPF级C57BL/6小鼠70只，平均体重20～25g，按性别、体重随机取10只为空白组，其余动物接种Hp造模，造模成功后按性别随机分为A(模型组)、B(蒿芩清胆汤低剂量组4g·kg-1)、C(蒿芩清胆汤中剂量组8g·kg-1)、D(蒿芩清胆汤高剂量组16g·kg-1)、E(丽珠胃三联组0.25g·kg-1)、F(三九胃泰组5.2g·kg-1)组，每组10只，雌雄各半，并作标记。空白组和模型组小鼠以等量生理盐水灌胃，每天1次，连续2周。实验过程中密切观察小鼠一般情况，如毛发光泽度、体重变化、饮食情况、活动情况、精神状态等，并观察有无死亡情况。

2.3 取材方法

禁食24h后采用颈椎脱臼法处死小鼠并进行解剖，将胃组织沿胃大弯侧剪开，采用生理盐水冲洗后，按组别放入装有复合固定液的标本瓶中固定，贴标签保存。分别进行Hp检测和胃黏膜病理学观察，采用免疫组化法进行NF-κBp6、IL-8、iNOS检测，结果采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统进行分析，统计比较每组小鼠阳性表达的平均光密度。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 一般状态

空白组小鼠在造模和给药期间活动正常、反应灵敏、毛发光泽、饮食可，无死亡小鼠。其他各组中部分小鼠在造模后第2天起可见活动量少、饮食减少、毛发稀疏、精神萎靡、倦卧，有部分小鼠死亡。

3.2 胃黏膜病理组织学观察

空白组：黏膜单层柱状上皮、腺体结构完整，未见明显炎细胞浸润。模型组：小鼠胃窦部炎症程度较重，腺体结构紊乱，可见较多炎性细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主。与模型组比较，各治疗组小鼠上述病变程度均有所减轻，其中以丽珠胃三联组、蒿芩清胆汤高剂量组、三九胃泰组小鼠组织学改善最为明显，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

3.3 对胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表达的影响

与模型组比较，三九组、丽珠组、蒿芩清胆汤高剂量组小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表达均有所降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，但三组间比较无统计学差异(P>0.05)。蒿芩清胆汤低、中剂量组小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、表3、表4。

表1 各组小鼠胃组织慢性炎症病变程度及积分比较 (±SD)

注：模型组与空白对照组比较，**P<0.01；其余组与模型对照组比较，△△P<0.01。

表2 各组小鼠胃组织 NF-κB p65平均光密度比较 (±SD)

注：模型组与空白对照组相比，**P<0.01；其余组与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各组小鼠胃组织IL-8平均光密度比较 (±SD)

注：模型组与空白对照组比较，**P<0.01；其余组与模型对照组比较，△P<0.05。

表4 各组小鼠胃组织 iNOS平均光密度比较 (±SD)

注：模型组与空白对照组比较，**P<0.01；其余组与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

4 讨论

H.pylori感染所致慢性胃炎属于中医学中“痞满”“胃脘痛”等范畴，中医学认为H.pylori是外感湿热之邪，慢性胃炎的主要病机为湿热中阻、气机不畅、胃失和降，临床主要表现为口苦、咽干、恶心、干呕、吐酸、上腹部胀满不舒或疼痛，其病位主要在胃，但与脾、肝、胆密切相关。目前许多学者认为Hp多为湿热之邪，HAG患者在证候分布(脏腑气血津液辨证)上以湿热中阻(脾胃湿热)证候为主[4]，故治疗应以清热利湿、利胆和胃为法。蒿芩清胆汤为清热利湿、利胆和胃的代表方，现代药理学研究表明[5]，其具有抑制胃酸分泌、促进胃排空，保护胃黏膜和止泻等作用。临床研究也亦证实蒿芩清胆汤对湿热证之慢性胃炎具有显著的治疗效果[6]。

Hp感染人体后定植于胃黏膜，激活转录因子NF-κB。NF-κB是炎症和免疫反应过程中一类重要的转录因子，具有广泛的生物学活性，在黏膜炎症和修复中具有重要作用，其中P65亚单位在 NF-κB基因转录活性中起主要作用[7]。现代研究表明[8]，Hp感染诱导和激活胃黏膜NF-κBp，促使上皮细胞分泌IL-8等趋化因子，激活iNOS和其他炎症介质释放，进而损伤胃黏膜。此外，多种炎性细胞因子以及炎症介质都受到NF-κB的调控，如TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、集落刺激因子、白三烯等[9]。 已有资料表明[10-13]，Hp感染在诱导胃上皮细胞NF-κB 活化的同时，还可导致IL-8、TNF-α等水平升高；Hp感染诱导胃上皮细胞表达iNOS，这一作用也主要通过NF-κB 激活途径介导。研究表明[14]，如果抑制NF-κB激活，iNOS的表达将会减少。因此，在治疗幽门螺杆菌相关性胃炎时，可通过中药下调NF-κBp6表达，进而抑制NF-κBp6激活来减轻胃黏膜炎症程度。

本研究表明，蒿芩清胆汤可显著降低Hp感染小鼠胃黏膜IL-8、iNOS表达水平，下调NF-κBp6表达，与三九胃泰、丽珠胃三联治疗效果接近，并对Hp感染所致胃黏膜损伤具有修复作用，其作用机制可能与下调NF-κB P65表达，降低胃黏膜IL-8、iNOS过度表达有关。

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(责任编辑：尹晨茹)

2014-10-10

四川省科技厅科技计划项目(2013JY0110)

杨馥语(1988-)，女，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中医内科脾胃病。

谭万初(1956-)，成都中医药大学附属医院教授，硕士生导师，研究方向为中医内科脾胃病实验和临床。

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0016-03

10.11954/ytctyy.201504008