海风藤正丁醇提取物抗类风湿作用药效学研究

2015-05-02阙金花张玉琴褚克丹

亚太传统医药 2015年4期

关键词：正丁醇抗炎低剂量

秦晴，阙金花，张玉琴，李煌，徐伟，褚克丹

(福建中医药大学药学院，福建福州 350122)

海风藤正丁醇提取物抗类风湿作用药效学研究

秦晴，阙金花，张玉琴，李煌，徐伟，褚克丹*

(福建中医药大学药学院，福建福州 350122)

目的：研究海风藤正丁醇提取物的抗类风湿活性。方法：采用热板法、棉球肉芽法、耳肿胀法等建立炎症和疼痛模型，观察海风藤正丁醇提取物对大鼠、小鼠的抗炎镇痛作用。结果：海风藤正丁醇提取物各剂量组均表现出较好的抗炎镇痛效果，且抗炎作用强于镇痛作用。结论：海风藤正丁醇提取物具有较好的抗炎镇痛作用，可作为抗类风湿关节炎的潜在开发药物。

海风藤；抗炎镇痛；类风湿关节炎

海风藤为胡椒科植物风藤(Piperkadsura(Choisy) Owchi.)的干燥藤茎，具有祛风湿、通经络、止痹痛的功效，用于风寒湿痹、肢节疼痛、筋脉拘挛、屈伸不利等症的治疗[1]。该药最早记载于清代叶天士的《本草再新》，谓“海风藤行经络、和血脉、宽中理气、下湿祛风”，在民间亦广泛用于风湿痹证的治疗。海风藤的主要化学成分为胡椒碱类生物碱、木脂素、挥发油，次要化学成分为黄酮和脂肪酸类化合物[2-3]。

查阅总结相关文献可知，海风藤的药理作用研究主要集中在脑损伤保护方面[4-6]，对其抗风湿作用研究较少，仅有少数学者对其提取物进行了抗炎作用研究[7-8]。类风湿关节炎的临床表现为关节肿胀、疼痛，炎症和疼痛是其两大主要症状，因此临床治疗以抗炎、镇痛为主。本研究采用热板法、棉球肉芽法、耳肿胀法等建立炎症和疼痛模型，观察海风藤正丁醇提取物对大鼠的抗炎镇痛作用，为今后进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠，6周龄，体重(180±20)g，雄性；KM小鼠，4周龄，体重(20±2)g，雌雄各半，均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXX(沪)2008-0005。福建中医药大学实验动物中心提供SPF级医学实验动物环境设施，使用许可证号：SYXK(闽)2009-0001。

1.2 仪器与设备

YLS-Q4耳肿胀打耳器(淮北正华生物仪器设备有限公司)；SE202F型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；YLS-7B型足趾容积测量仪(山东省医学科学院设备站)；YLS-6A型智能热板仪(山东省医学科学院设备站)；OS200-PH型光学显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；TGL-5-A台式水平离心机(上海安亭科学器材公司)；MILLI-Q超纯水装置(美国MILIPORE公司)；ELX80O酶标仪(美国BIO-Tek公司)；101C-3电热鼓风干燥箱(上海实验仪器总厂)。

1.3 药物与试剂

海风藤：福州回春中药饮片厂有限公司，批号：130928；阿司匹林片：浙江医药股份有限公司，批号：185501；消炎痛：临汾奇林药业有限公司，批号：1009041；地塞米松：浙江仙琚制药有限公司，批号：131189；二甲苯：国药集团化学试剂有限公司，批号：F20050608；角叉菜胶：美国Sigma公司，批号：073K0052；冰醋酸：南京化学试剂厂，批号：08260。

2 方法

2.1 药物制备

取海风藤7kg，用70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，得到乙醇提取物。旋转蒸发回收乙醇，浸膏加水混悬后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，回收溶剂后蒸干得到正丁醇部分377.37g，分别用0.5% CMC-Na溶液配成7.72mg/kg(低)、15.44mg/kg(中)、30.88mg/kg(高)的海风藤提取液。

2.2 二甲苯所致小鼠耳肿胀模型[9-10]

将50只KM小鼠随机分为五组，分别为模型对照组、阳性对照组(地塞米松)、海风藤正丁醇提取物高、中、低剂量组。各实验组小鼠每天按设定剂量连续灌胃给药1周，每天1次，模型对照组小鼠给予等量溶媒。

末次给药后30min于每只小鼠左耳两面涂抹适量(0.05mL)纯二甲苯，以右耳为对照，建立炎症小鼠模型。1h后，将小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线取下两耳，用打孔器分别在两耳同一部位取下圆耳片，分别称重，以左右耳片重量之差作为耳廓肿胀度，评价药物的抗炎效应，并计算其抑制率。耳廓肿胀抑制率=(左耳重量-右耳重量)/左耳重量×100%。

2.3 棉球所致大鼠肉芽肿模型[9-10]

取大鼠50只，体重180～220g，雄性，随机分为五组，每组10只，分别为模型对照组、阳性对照组(地塞米松)、海风藤正丁醇提取物高、中、低剂量组。实验前所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，背部剃毛。采用手术法于大鼠背部皮下植入已消毒称重的棉球，缝合皮肤，外部消毒。于手术当日开始给药，各实验组大鼠每天按设定剂量连续灌胃给药1周，每天1次，模型对照组大鼠给予等量溶媒。于末次给药后处死大鼠，取出植入的棉球，仔细剥离附着组织，放置烘箱60℃烘干，称重，减去原棉球重，即为肉芽组织重量，计算抑制率。抑制率=(给药组肉芽肿重量-模型对照组肉芽肿重量)/模型对照组肉芽肿重量×100%。

2.4 角叉菜胶所致大鼠足肿胀模型[9-10]

取大鼠60只，随机均分为六组，分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(消炎痛)和海风藤正丁醇提取物高、中、低剂量组，各实验组大鼠每天按设定剂量连续灌胃给药14天，空白对照组、模型对照组大鼠给予等量溶媒。

末次给药后1h于大鼠右后足踝关节处作标记，按足容积法测定2次，取平均值作为给药前正常足容积(mL)。然后将1%角叉菜胶生理盐水0.1mL注入大鼠左后肢足趾皮下制造炎症模型，分别于注入后l、2、4、6h测定大鼠足容积，以足肿胀度评价海风藤提取物的抗炎效应。

2.5 热刺激所致小鼠疼痛反应模型[9-10]

实验前，将小鼠置于热板仪(55.0±0.5℃)上，立刻计时，记录小鼠从置于热板上到出现舔后足现象的时间(s)，作为小鼠的正常痛阈值。凡舔后足时间小于5s或大于30s以及跳跃不安者，均弃之不用。

取小鼠50只，雌雄各半，随机分为空白组、阳性对照组(消炎痛)、海风藤正丁醇提取物高、中、低剂量组，各实验组小鼠每天按设定剂量连续灌胃给药14天，每天1次，空白组小鼠给予等体积溶媒。末次给药lh后将各组小鼠分别放入热板仪内，以舔后足作为疼痛反应的指标，记录小鼠自投入热板至出现舔后足反应的时间。60s内无反应的小鼠应立即取出，以免烫伤，其痛阈值按60s计算，以痛阈值评价海风藤提取物的镇痛作用。

2.6 醋酸所致小鼠扭体反应模型[9-10]

取小鼠50只，雌雄各半，随机分为模型组、阳性对照组(阿司匹林)、海风藤正丁醇提取物高、中、低剂量组，各实验组小鼠每天按设定剂量连续灌胃给药3天，每天1次，模型对照组小鼠给予等体积溶媒。末次给药lh后将0.6%醋酸溶液注射于小鼠腹腔内，以引起深部、大面积而持久的疼痛刺激，致使小鼠产生扭体反应。以小鼠腹部凹陷、双后肢伸展为扭体反应的指标，观察各组小鼠出现扭体反应的时间(潜伏期)及15min内扭体反应的次数。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

涂抹二甲苯后，与右耳比较，小鼠左耳产生明显肿胀。与模型对照组小鼠比较，各给药组小鼠左耳肿胀程度均有所减轻，差异具有统计学意义(P<0.01)。表明海风藤正丁醇提取物能明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀，抑制率均大于35%，且随着剂量的增加抑制作用增强。结果见表1。

表1 海风藤正丁醇提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 (±s)

注：与模型组比较，**P<0.01。

3.2 棉球所致大鼠肉芽肿模型

大鼠背部皮下植入灭菌棉球后可形成慢性肉芽肿，以此模拟慢性炎症反应。与模型组大鼠比较，中、高剂量组大鼠肉芽肿重量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，且低剂量组也有抑制趋势，但与模型组大鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。海风藤正丁醇提取物对慢性炎症有较强抑制作用，且以高剂量组作用最为显著。详见表2。

表2 海风藤正丁醇提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响 (±s)

注：与空白对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。

3.3 对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

大鼠左后足注射1%角叉菜胶后，足爪出现明显肿胀。各组大鼠给予相应药物后，空白对照组、海风藤正丁醇提取物高、中、低剂量组大鼠足肿胀值均低于模型组；高剂量组大鼠致炎后2、4、6h足肿胀值与模型组比较差异具有极显著性意义(P<0.01)，但中、低剂量组大鼠足肿胀值与模型组比较无统计学差异(P>0.05)，提示高剂量海风藤正丁醇提取物能有效抑制角叉菜胶所致足肿胀。详见表3。

表3 海风藤正丁醇提取物对角叉菜胶致大鼠足肿胀影响 (±s)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与空白组比较，##P<0.01。

3.4 对热刺激所致小鼠疼痛反应的影响

与空白组比较，海风藤正丁醇提取物各剂量组小鼠疼痛反应出现时间均延长，其中高剂量组延长作用最明显，差异具有统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 海风藤正丁醇提取物对热刺激致小鼠疼痛反应影响 (±s,s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 对小鼠化学刺激法疼痛反应的影响

与模型组比较，海风藤正丁醇提取物高、中剂量组小鼠疼痛反应出现时间稍延长，15min内扭体次数明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。说明海风藤正丁醇提取物对化学刺激法引起的小鼠疼痛反应有明显抑制作用，且作用强度与药物剂量有一定关系。详见表5。

表5 海风藤正丁醇提取物对小鼠化学刺激法疼痛反应影响 (±s,s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

本研究采用热板法、棉球肉芽法、耳肿胀法等建立炎症和疼痛模型，观察海风藤正丁醇提取物对大鼠、小鼠的抗炎镇痛作用。从炎症模型实验中可以看出，海风藤正丁醇提取物低、中、高剂量都有较好的抗炎效果，但在镇痛实验中，低剂量海风藤正丁醇提取物未显示出明显镇痛效果。表明海风藤正丁醇提取物各剂量组均表现出较好的抗炎镇痛效果，且抗炎作用强于镇痛作用，为进一步研究其抗风湿活性奠定了基础。

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(责任编辑：尹晨茹)

2014-10-20