孔德伟 聂强 朱永

【摘 要】目的：探讨食品中色素的测定方法，对现行GB/T5009.35-2003，《食品中合成色素测定》进行提出修订建议。方法：样品经提取后，经聚酰胺粉吸附，用氨-乙醇溶液解吸附，中和后水浴浓缩，定容过滤，以甲醇与乙酸铵溶液为流动相，梯度洗脱，紫外254nm检测，外标定量。

【关键词】食品 合成色素 检测 方法 改进

色素作为食品添加剂，可分为食用天然色素和人工合成色素两大类，前者一般较为安全，人工合成色素是用人工化学合成方法所得的有机色素，主要是以煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成。本身无营养价值，但由于成本低廉，色泽鲜艳，着色力强，配色方面，可以增加食品的美观，在食品生产过程中被广泛使用。近几年，在巨大的经济利益的驱使下，导致食品合成色素超标，研究资料表明，过量的摄入人工合成色素，将会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害，因此加强人工合成色素管理，提高人工合成色素快速、准确检验十分必要。

1 《食品中合成着色剂的测定》GB/T5009.35-2003在检验中遇到的问题

《食品中合成着色剂的测定》GB/T5009.35-2003，第一法为高效液相色谱法，该方法具有检测灵敏度高、混合色素分离性能完全等优点，且随着液相色谱仪的普及，该方法已被广泛的采用，但该方法在分析过程中存在以下几个方面的问题：①固体样品由于本身有很大的粘稠性，在G3垂融漏斗抽滤时，很难抽滤，有的样品抽滤8、9个小时还不能完全抽滤干净，严重的造成了检验效率低、人工合成色素损失率高等问题。②在聚酰胺吸附法中，GB/T5009.35-2003要求试样溶液加柠檬酸调PH值到6，这样会因PH过高引起人工合成色素在PH为6的弱酸环境内有一定的溶解度，导致在用甲酸-甲醇洗涤天然色素时，工合成色素损失，造成检验结果偏低。③流动相： GB/T5009.35-2003的 5.3.2中规定，流动相：甲醇：乙酸铵溶液（PH=4.0），这样会因流动相成酸性，导致人工合成色素在流动相内的溶解度降低，会引起结果不出峰和C18柱子的使用寿命缩短。④梯度洗脱：GB/T5009.35-2003的5.3.3中规定：甲醇：20%～35%，3%/min；35%～98%，9%/min；98%继续6 min，该规定缺少甲醇：98%～20%以及甲醇：20%的持续时间这两个梯度洗脱过程，甲醇：20%的持续时间应根据柱压是否稳定来确定，否则会引起保留时间发生严重漂移，造成无法对人工合成色素的峰进行定性。⑤由于亮蓝既溶于酸又溶于碱，被吸附的亮蓝极易被甲醇-甲酸溶液洗脱，回收率几乎为0，造成检验结果严重偏低，因此应对亮蓝的检验进行修定。

2 对《食品中合成着色剂的测定》GB/T5009.35-2003的几点建议

针对上述问题，本中心根据多年的对食品人工合成色素检验经验，提出以下建议：

①对于固体样品在G3垂融漏斗难以抽滤问题建议称取5.00g～10.00g粉碎样品放入100mL烧杯中，加30mL10%的氨水搅拌15min进行溶解，然后用快速滤纸进行过滤、洗涤，每次用10%的氨水5mL，洗涤3～5次，收集滤液再用柠檬酸调PH值到3左右，这样就可以把固体样品转化为液体样品，再用G3垂融漏斗抽滤就比较容易抽滤了，因为人工合成色素是在碱性溶液中有较高的溶解度，样品经过上述方法处理后，绝大部分人工合成色素都转化到滤液中了，这样就解决了固体样品在G3垂融漏斗抽滤难的问题和人工合成色素损失率较高的问题。②在聚酰胺吸附法中，GB/T5009.35-2003的5.2.1中要求试样溶液加柠檬酸调PH值到6，这样会因PH过高引起人工合成色素在PH为6的弱酸环境内有一定的溶解度，导致在用甲酸-甲醇洗涤天然色素时，工合成色素损失，造成检验结果偏低。建议用柠檬酸试样的PH值到3，这样就可以避免人工合成色素在用甲酸-甲醇洗涤天然色素时，工合成色素损失的问题。③流动相： GB/T5009.35-2003的 5.3.2中规定，流动相：甲醇：乙酸铵溶液（PH=4.0），这样会因流动相成酸性，导致人工合成色素在流动相内的溶解度降低而析出，会引起结果不出峰和C18柱子的使用寿命缩短，建议调流动相乙酸铵溶液的PH值到7左右。④梯度洗脱：GB/T5009.35-2003的5.3.3中规定：甲醇：20%～35%，3%/min；35%～98%，9%/min；98%继续6 min，建议应增加甲醇：98%～20%以及甲醇：20%的持续时间这两个梯度洗脱过程，确保在进行下一样品时流动相的比例过度到起始状态，甲醇：20%的持续时间应根据柱压是否稳定来确定，否则会引起保留时间发生严重漂移，造成无法对人工合成色素的峰进行定性。⑤如样品中含有亮蓝人工合成色素，由于亮蓝既溶于酸又溶于碱，被吸附的亮蓝极易被甲醇-甲酸溶液洗脱，回收率几乎为0，造成检验结果严重偏低，建议取两份样品（若是固体样品用上述方法转化为液体样品），一份直接进行调PH值、浓缩、定容、过滤后用于测定亮蓝，一份按照5.2规定的处理方法测定其他色素。

3 试验与结果

3.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪（带自动进样器）；真空泵；超声波清洗器；抽滤器；G3垂融漏斗；0.45 μm过滤头。

3.2 试剂

色谱纯甲醇；二级水（电导率<0.10 mS/m，25℃）；色素标准溶液[GBW（E）]；乙酸铵溶液（0.02 mol/L）；甲醇一甲酸混合溶液（6+4）；无水乙醇一2%氨水一水混合溶液（7+2+1）；聚酰胺粉（过200目）；乙酸溶液（20%）。

3.3 色素提取

称取固体样品绿豆糕7.00g共12份，其中6份用于加标回收试验（柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝均为0.1mg），按上述建议①至⑤制成的样品溶液调pH到3，加热至60℃，将1 g聚酰胺粉加少量水调成粥状，倒人样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=6的水洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸溶液洗涤3～5次，再用水洗至中性，用乙醇一氨水一水混合液解吸3～5次，每次3 ml，收集解吸液，加乙酸溶液中和，80℃～85℃水浴蒸发浓缩至20%，加水定容至10 ml，经针头过滤器（0.45μm）过滤，待测。

3.4 色谱条件

色谱柱：SinoChrom ODS—BP柱（250 mm×4.6 mm×5μm），C18预柱，柱温为25℃，流动相：A为甲醇，B为乙酸铵溶液（0.02 mot/L，PH值为7），梯度洗脱，流速：1.0 mL/min，进样量10μl，检测波长254 nm。

3.5 流动相编程（见表1）

4 结语

实验表明，在应用GB/T5009.35—2003第一法过程中，按照上述5点建议控制实验条件：吸附、解吸附、浓缩温度及体积，梯度洗脱，结果：样品抽滤快捷、工合成色素损失低、各色素保留时间漂移较小、各色素分离度良好，同时解决了亮蓝不能检出的问题，各色素回收率满意。