包赛依娜，李顺琪，兰义宾，潘秋红*

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院 葡萄与葡萄酒研究中心，北京 100083）

涩感是评价葡萄酒质量的重要指标之一，葡萄酒中涩感来源于酒体中单宁酸与人体口腔唾液中蛋白的结合而产生的收敛性[1]。当前，对葡萄酒涩感的评价主要是通过品酒师的感官品评，没有相对客观的评价标准，受个体状态、品评环境等的影响较大，同一酒样不同批次的品评结果存在较大偏差，使得葡萄酒涩度难以被客观分级[2-4]。如葡萄酒中糖、酸、酒精含量等可与单宁酸相互作用而影响品评者对涩感的感知，增加了感官品评的难度[4-8]；涩感的强弱也与酒在口中停留的时间和重复暴露的次数有关，它们可以影响样品在嘴中的残余和遗留[9-10]，需要一个有效的品尝和口腔冲洗制度。因此，建立一个涩感的定量评价方法，可以在很大程度上提高葡萄酒质量评价的准确性。

前人的研究中，利用葡萄酒样中单宁酸与白蛋白或牛血清白蛋白等结合，分析结合能力以指示涩度变化[11]，但是单纯的蛋白质溶液体系并不能真实地反映口腔唾液环境与单宁酸发生的反应。口腔唾液中含有大量的电解质，离子种类和强度等都会对蛋白与单宁酸的结合产生影响[2]。口腔唾液模拟溶液由蛋白质、电解液等物质组成[2]。本试验拟建立单宁酸与口腔唾液模拟溶液反应体系，探究单宁酸浓度、作用时间、温度和蛋白浓度对结合反应的影响，建立葡萄酒涩度定量分析方法，为葡萄酒品质评价及涩感相关的理论研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 葡萄酒样品

试验所用的试材取自不同年份、不同产区和不同品种的葡萄酒，样品信息如表1所示。每个样品为750 mL，取其中50 mL用于涩度分析，剩余的用于感官品评。

表1 感官品评及涩度分析所用的葡萄酒Table 1 Wine samples for sensory evaluation and astringency analysis

1.1.2 化学试剂

氯化钾、氯化钠、氯化镁（MgCl2·6H2O）、氟化钠、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钙（CaCl2·2H2O）和磷酸氢二钾（K2HPO4）均为分析纯：北京化学试剂公司；蛋白胨和单宁酸（分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司；实验室纯净水用Milli-Q（Millipore，Bedford，MA）纯化水系统制得。

1.1.3 人体口腔模拟唾液的制备

人体口腔模拟唾液包括了电解质溶液和蛋白质母液两类组分[2]。

电解质溶液的制备：称取1.3 g 氯化钾，0.1 g 氯化钠，50 mg 氯化镁（MgCl2·6H2O），0.1 g氯化钙（CaCl2·2H2O），25 μg 氟化钠，27 mg 磷酸二氢钾 和35 mg 磷酸氢二钾，用纯净水溶解，并定容至1 L。

蛋白母液的配制：用电解质溶液作为溶剂，配制3 g/L蛋白胨溶液即为蛋白母液。

1.1.4 单宁酸母液配制

单宁酸母液：用电解质溶液为溶剂，配制2 g/L为单宁酸母液。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GL-20G-II离心机：上海安亭科学仪器厂；XMTDA数显调节恒温水浴锅：余姚市亚星仪器仪表有限公司；QL-901涡旋振荡器：海门市贝尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 涩度定量评价方法建立

以口腔模拟液中的电解质溶液为空白，对含单宁酸的电解质溶液进行全波长扫描，确定最大吸收峰波长。根据单宁酸与蛋白结合产生收敛性的原理，通过测定不同反应组在最大吸收峰波长下的吸光度值（OD）可判断未结合的单宁酸含量，OD值越小，表明与蛋白结合的单宁酸量越多[11-12]，涩度越强。

将不同体积的单宁酸母液（2 g/L）与蛋白母液（3 g/L）混合，以电解液稀释至6 mL，使蛋白质终质量浓度分别为0.05 g/L、0.10 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L、1.50 g/L，单宁酸终质量浓度分别为0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L。每组两个平行，分别在不同温度（34 ℃、37 ℃、40 ℃）及不同水浴时间（0.5 h、1.0 h、2.0 h）反应。反应液常温条件下离心（10 000 r/min、6 min）后，取上清液，在最大吸收峰波长下测定吸光度值。

以一定质量浓度的单宁酸与系列质量浓度的蛋白反应，用蛋白质量浓度对吸光度值作图，获得该质量浓度的单宁酸下曲线斜率。用不同质量浓度的单宁酸对其相应的曲线斜率作图，得到单宁酸标准曲线。

1.3.2 样品涩度检测

以样品代替单宁酸母液，按照1.3.1步骤，与梯度蛋白溶液反应，绘制波长330 nm处的吸光度值与蛋白质量浓度之间的对数曲线，得到其斜率，代入标准曲线，即可得到样品的涩度值（用斜率绝对值表示）。

1.3.3 感官品评

葡萄酒品尝、漂洗程序需要避免残留和疲劳，这就要求品尝者们在品尝不同葡萄酒之前用果胶冲洗液漱口。果胶冲洗溶液用商业果胶以5 g/L的质量浓度制备。溶液在4 ℃条件下存储，感官分析之前储藏时间不超过3 d[1]。

品评者为15位经过短暂培训的中国农业大学葡萄与葡萄酒工程专业学生（3男12女），年龄在20～22岁之间。在培训课中主要介绍了每个属性的感官方法和强度范围，用单宁酸配制5个涩感梯度溶液，作为训练样本，让品评者感知涩味属性，并对涩感强弱进行界定，设定为5个涩感级别分别对应为分数值1、2、3、4、5。这5个溶液分别为：（1）体积分数为12%乙醇+0单宁酸；（2）体积分数为12%乙醇+0.2 g/L单宁酸；（3）体积分数为12%乙醇+0.4 g/L单宁酸；（4）体积分数为12%乙醇+0.6 g/L单宁酸；（5）体积分数为12%乙醇+0.8 g/L单宁酸。遵循先白后红、先干后甜的顺序进行品尝。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

为了解在口腔模拟溶液中单宁酸的最大吸收波长，对含单宁酸的电解质溶液进行了全波长扫描，由图1可知，在波长330 nm处有最大吸收值。这与前人的报道有所不同，如刘彦霞等[3，13-15]采用波长280 nm测定干红葡萄酒的涩度，分析体系为水溶液，推断可能是模拟口腔溶液的电解质组分导致单宁酸吸收峰发生偏移。在后续研究中，采用波长330 nm条件下测定反应体系中剩余单宁酸的含量。

图1 单宁酸-口腔模拟液体系的全波长扫描Fig.1 Full wavelength scanning of tannin-oral model solution

2.1.1 反应温度的确定

将不同质量浓度（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）的单宁酸与1.5 g/L的蛋白胨溶液混合，分别在34 ℃、37 ℃、40 ℃反应2 h，结果如图2所示。

图2 不同质量浓度单宁酸与蛋白质溶液(1.5 g/L)在不同温度下反应时吸光度值的变化Fig.2 Changes of absorbance values of the reaction systems containing 1.5 g/L protein solution and different concentrations of tannins at different temperature

由图2可知，37 ℃条件下单宁酸与蛋白结合呈现最好的线性关系，单宁酸与吸光度值的相关系数最大（R=0.994），曲线趋势最为稳定，考虑37 ℃也比较接近人体口腔温度，因此在后续研究中，反应温度设定在37 ℃。

2.1.2 作用时间的影响

37 ℃条件下0.5 g/L蛋白质溶液与不同质量浓度单宁酸（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）分别作用0.5 h、1.0 h和2.0 h，结果见图3。

图3 不同质量浓度单宁酸与蛋白质溶液(1.5 g/L)在不同时间下反应时吸光度值的变化Fig.3 Changes of absorbance values of the reaction systems containing 1.5 g/L protein solution and different concentrations of tannins at different temperature

由图3可知，0.5 h和1.0 h的曲线波动较大，而作用时间2.0 h时，曲线呈线性且趋势稳定。由此推测作用时间2.0 h，单宁酸与蛋白已充分结合，综合考虑时间利用率及完全反应情况，将该方法的作用时间设定为2.0 h。

2.1.3 蛋白质质量浓度的影响

葡萄酒中单宁酸含量一般为0.2～0.8 g/L[15]，普通型酿造工艺及常见葡萄品种的葡萄酒内单宁酸含量约为0.4 g/L左右。因此本试验分析了0.4 g/L单宁酸与不同质量浓度（0.05～3 g/L）蛋白的结合反应，结果如图4所示。

由图4可知，蛋白质量浓度越大，与单宁酸结合的越多，剩余的单宁酸越少，吸光度值越小，蛋白质量浓度与吸光度值的变化呈一定的线性关系（R=0.987）。当少量的蛋白加入单宁酸溶液中时，蛋白质-单宁酸相结合，形成云状沉淀[16]。起初单宁酸质量浓度相对于蛋白的质量浓度要高，因此所有的蛋白质都被一定量的单宁酸沉淀。即起始时波长330 nm处吸光度值迅速下降。然而，随着加入蛋白量的增加，溶液中单宁酸的质量浓度变得越来越低直到完全消失。过量的蛋白不会沉淀，吸光度值下降并与蛋白质量浓度增加不呈线性关系。建立了蛋白质量浓度对数与吸光度值变化之间的关系，其相关系数R=0.992，表明用对数方程可以更好地反映蛋白与单宁酸反应曲线。

2.2 单宁酸质量浓度与曲线斜率之间的线性关系

单宁酸与口腔唾液蛋白结合生成收敛性物质，人可感知到涩感[1]。蛋白与单宁酸的结合能力越强，则涩感越强。对数曲线的斜率可以反映结合能力的大小，即斜率的绝对值越大，涩感越强，因此，样品涩度的相对强弱可以用斜率大小来衡量。

根据一定质量浓度的单宁酸与一定质量浓度的蛋白反应所对应的吸光度值，获得对数曲线的斜率，将不同质量浓度（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L）单宁酸与不同质量浓度（0、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L）蛋白反应所得到的对数曲线斜率作图，得到单宁酸质量浓度与对数曲线的斜率绝对值之间的关系，结果见图5。

图5 对数曲线斜率绝对值与单宁酸初始质量浓度之间的线性关系Fig.5 Linear relationship between the slope of the logarithmic curve and the initial concentration of tannin

由图5可知，该曲线可作为单宁酸标准曲线，用于衡量样品涩度的相对强弱。曲线线性回归方程为y=0.015 4x+0.012 4，两者的相关性R达到0.972，表明它们呈现较好的线性关系。

2.3 感官品评结果与涩度定量评价方法检测结果的相关性

基于上述确定的反应条件和标准曲线，分析了不同年份、不同品种和不同酿造工艺生产的葡萄酒样品的涩度，并进行了感官品评，结果分别如图6A、6B所示。除了酒样14、15、16感官品评与定量评价没有对应关系之外，其他样品感官品评的分数越高，涩度越大，相应的曲线斜率的绝对值越高，涩度越大，两者的相关性结果见图6C。由图6C可知，21个测试样品感官品评与涩度定量评价之间的相关系数R达到0.918，线性回归方程为y=-0.004 7x-0.006 7，表明本研究所建立的涩度定量评价方法与感官品评结果基本相符，可用于葡萄酒涩度的定量评价。

图6 21个酒样涩感的感官品评(A)及涩度定量评价(B)以及二者关系(C)Fig.6 Results of sensory evaluation (A),astringency quantitative evaluation (B) and their correlation (C) for 21 wine samples

3 结论

本研究建立的葡萄酒涩度定量检测方法为：酒样与不同质量浓度（0～3 g/L）蛋白在电解质溶液中，37 ℃作用2 h，常温条件下10 000 r/min离心6 min，上清液在330 nm波长下检测样品吸光度值，所得的对数曲线的斜率大小可表示涩度大小，采用该方法定量检测涩度结果与感官品评结果基本一致，其相关性为R=0.918。相比于传统的感官品评将涩度主观分级，该方法可定量葡萄酒涩度，克服了感官品评中个体差异、感官疲劳和其他呈味物质影响等因素造成的误差，使分析结果更具科学性。此外，该方法也可用于大批量的酒样涩度分析，使葡萄酒涩度分析变得快速简便，并使不同批次酒样分析具有可比性。

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