李天芝，于新友，沈志强，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪圆环病疫苗的研究进展

李天芝1，于新友1，沈志强1，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)是圆环病毒科(Circoviridae)、动物圆环病毒属的成员。该病毒科是国际病毒分类委员会(ICTV)第6次学术报告会新命名的一个科，是已知能自行复制的最小的哺乳动物病毒。PCV可以分为PCV1和PCV2两种血清型。PCV1无致病性，但广泛存在猪体内及猪源代细胞系，1974年，Tischer首次从PK-15猪肾传代细胞系中分离。PCV2具有致病性，该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，可引起断奶猪和育肥猪生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、贫血、出现黄疸现象，剖检后发现有淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液性气管炎、间质性肺炎和肾炎，给养猪业造相当严重的经济损失。1991年，在加拿大首次暴发该病，随后，世界各国家和地区都有该病的报道，并在患断奶仔猪多系统衰竭综合征 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(Porcine Dermatitisand Nephropathy Syndrome，PDNS)等病猪体内分离到PCV2，并证明PCV2与这些严重威胁着养猪业的疾病密切相关。目前该病毒引起了国内外兽医界的广泛关注。

1 流行特点

猪是PCV2的天然宿主，各种年龄、不同性别的猪都可感染病毒，但以哺乳期和育成期的猪最易感，尤其是5～12周龄的仔猪，一般于断奶后2～3天开始发病，急性发病猪群中，病死率可达10%，在疾病流行感染过的猪群中，发病率和死亡率都较低，如果并发或继发细菌或病毒感染可使死亡率大大增加。猪皮炎与肾病综合征一般为散发，猪只在断奶后2～3天发病，不发烧或者轻微发烧，精神沉郁，会阴部、腹部皮下水肿，渗出性皮炎，肾脏极度肿大，病程短，多数在发病后三天内死亡。虽然许多国家和地区的猪群中存在猪II型圆环病毒(PCV2)和由它引发的疾病，但是各国的流行状况之间存在很大差异。加拿大是首次报道PMWS的国家，但时至今日，多数农场的猪群中仍然只是散发，很少呈流行性发生PMWS，但是与PCV2有关的PNDS、心肌炎和繁殖障碍综合征等疾病正引起了人们更多的关注。

2 疫苗研究进展

2.1 灭活疫苗

采用人工培养大量繁殖免疫原性好的病原微生物，灭活、浓缩后按一定比例加入佐剂制成的疫苗，称为灭活疫苗，该疫苗可由病原微生物的完整个体组成，也可由其某些片段组成。灭活疫苗具有无毒、无害、效果稳定的优势。国、内外对猪圆环病毒灭活疫苗的研究已取得了巨大进展。法国梅利亚公司研究、开发的PCV2油包水乳剂灭活疫苗，在欧洲一些国家已注册上市，免疫后备母猪或经产母猪，仔猪可通过母源抗体获得保护，实验和临床证明，该疫苗有较好的效果，可减少感染、排毒，减轻临床症状。国内现有3种自主研发的猪圆环病毒常规灭活疫苗获准生产上市，其中PCV2灭活疫苗LG株由哈尔滨兽医研究所研制，该产品免疫应答快，效果好。另有南京农业大学研发的PCV2灭活疫苗SH株和北京大北农集团研制的PCV2灭活疫苗DBN-SX07株。

2.2 弱毒疫苗

采用抗原性好的无毒株、天然弱毒株或人工诱变的弱毒株制成的疫苗称为弱毒疫苗，该类疫苗具有不少优点如接种数量少，可刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，免疫效果好等，但也存在一些缺点如可能会发生毒力返强，储存和运输需在冷冻条件下，易失活，易被细菌污染等。Fenaux等将PCV2于PK-15细胞上传120代，结果120代病毒比初代病毒滴度高出一个log单位，同时，传30代后Cap基因110位脯氨酸变为丙氨酸(P110A)并维持到120代，此外191位精氨酸变为丝氨酸(R191S)，突变毒株在猪体内的接种实验表明，PCV2120代病毒血症时间和猪血清病毒含量明显低于第1代，即PCV2120代明显致弱。也有人将PCV2的ORF2克隆到缺失ORF2的PCV1的骨架中，得到PCV1-2嵌合型病毒。研究表明，该嵌合型病毒是减毒的，能刺激机体产生特异性免疫反应，可作为制备PCV弱毒疫苗的优势毒株，且具备不易发生毒力返强的优势。

2.3 亚单位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激机体产生特异性免疫应答的一类疫苗，称为亚单位疫苗。Zhou等首次在大肠杆菌中对缺失了核定位信号序列(NLS)的PCV2 cap蛋白(dCap)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)进行了融合表达，获得了rGST-dCap蛋白，实验证明，纯化的rGST-dCap蛋白以及去掉GST的rdCap蛋白，均可与抗PCV2猪血清发生特异性反应。用rdCap蛋白制备的单抗，可与感染PK15细胞的病毒粒子以及在PK15细胞中表达的Cap蛋白发生反应，同时表现对PCV2病毒粒子的中和活性。付玉洁等为评价猪圆环病毒(PCV)2a/2b两种基因型病毒株及其重组Cap蛋白 (rCap)之间的交互免疫，采用重组杆状病毒表达的2种Cap蛋白(PCV2a-rCap和PCV2b-rCap)亚单位疫苗。免疫小鼠后进行攻毒，结果，以PCV2a和PCV2b各为指示病毒对病毒抗血清和rCap蛋白抗血清进行交叉中和试验，同型病毒株与同型血清的中和抗体效价均高于异型病毒株。病理观察显示，免疫鼠均未见明显病理变化，攻毒对照鼠肺脏出现一定程度的病理损伤。刘丹等以重组杆状病毒表达的重组PCV2-Cap蛋白制备亚单位疫苗，免疫BALB/c鼠测定其抗体、中和抗体。结果表明，该蛋白亚单位疫苗能够提供良好的免疫保护效果，能够有效诱导小鼠产生明显的体液免疫应答。

2.4 核酸疫苗

构建含有外源抗原基因的重组质粒，免疫动物后，表达的特异性抗原蛋白通过与MHC-Ⅰ类或MHC-Ⅱ类抗原分子结合，刺激机体产生特异性免疫应答，该类疫苗称为核酸疫苗，又名DNA疫苗。Kamstrup等为了进一步探索衣壳蛋白免疫预防的适用性，采用了pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体克隆了PCV2的ORF2基因，并证实了此质粒能够在体外(通过直接表达蛋白)以及体内(通过对小鼠用基因枪注射质粒，诱导小鼠免疫产生抗体)进行表达。免疫试验结果表明，所构建的核酸疫苗均能诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应。金宁一等以pVAX1为载体，构建了表达PCV2 ORF1、ORF2和猪IL-18的核酸疫苗 pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18-ORF2、pVAX1-ORF2-ORF1、pVAX1-IL18-ORF2-ORF1等。用这些核酸疫苗免疫6～8周龄小鼠，结果表明，所构建的核酸疫苗均能诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应，其中核酸疫苗pVAX1-IL18-ORF2-ORF1免疫效果优于其他几种疫苗。宋云峰等将ORF2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建了pc-ORF2作为核酸疫苗免疫小鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，肌肉注射免疫接种Balb/c小鼠，结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，为防控猪圆环病毒II型感染提供了较为理想的侯选疫苗。BlanchardP等研究了PCV2基因疫苗及亚单位苗的免疫效力，仔猪用ORF2和 GM-CSF表达质粒首免，2周后用ORF2和GM-CSF表达质粒以及ORF2蛋白二免，免疫猪可抵抗PCV2的攻击，表明ORF2可诱导机体产生免疫保护。但通过比较，单独用PCV2基因疫苗两次免疫的效果低于亚单位苗的效果，不能完全抑制PCV2的增殖。Aravindaram等用构建的含PCV2 ORFl、ORF2、ORF3的3种重组质粒单独或联合免疫小鼠，2周后加强免疫，结果发现ORF2/3与ORFl/2/3这2种质粒组合免疫后PCV2病毒载量显著减少，诱导产生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2抗体水平均高于其他免疫组，小鼠的肺部病变也明显减轻。史小红等将重组真核表达质粒pcDNA-ORF1-ORF2免疫小鼠，2周后加强免疫，同时设置pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS对照。结果表明，该重组质粒诱导产生PCV2抗体水平与其他试验组相比差异显著。闫若潜等将猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒 (rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2)免疫10日龄健康仔猪，结果发现重组质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著。

2.5 活载体疫苗

采用弱毒或无毒病原微生物作为表达载体，对其导入外源抗原基因，制成疫苗后，接种动物，诱导机休产生特异性免疫应答反应，这类新型疫苗称为活载体疫苗。Wang等将PCV2 ORF2克隆入 E.coli/L.lac分泌型穿梭表达载体 pSEC: LEISS，构建了重组穿梭载体pSEC:LEISS-dCap，电转化乳酸菌NZ9000，获得能有效表达Cap蛋白的重组乳酸杆菌，将该菌培养液经口灌喂对Balb/c小鼠的生长发育没有影响，无毒性作用，能够诱发小鼠产生抗Cap蛋白的特异性IgG抗体，刺激肠道黏膜淋巴组织对其产生黏膜免疫。Kim等将PCV2的ORF2克隆至aroA突变的支气管炎博德特氏菌获得表达主要衣壳蛋白的重组博德特氏菌(BBS-MCP)，然后用重组细菌鼻内免疫猪，用PCV2攻毒后，在活BBS-MCP免疫的猪淋巴结中检测不到PCV2 DNA，结果表明BBS-MCP免疫能有效抵抗PCV2的感染，是发展抗PCV2感染的减毒活疫苗的又一选择。Ju等用减毒的伪狂犬病病毒(PRV)作为活病毒载体，构建了表达PCV2 ORF1-ORF2的重组病毒PRV-PCV2。试验表明，PRV-PCV2可诱导小鼠和猪产生强烈的抗PCV2和PRV抗体反应，在小鼠中产生针对PRV的免疫保护，可抵抗致死量的PRV Ea株的攻击，表明PRV-PCV2可用于抵抗PCV2和PRV感染。Song等将PCV2 ORF2基因插入pIEC-MV质粒，与伪狂犬病毒Tk-/ gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，产生一个重组的Tk-/gE-/ORF2(+)病毒。将其免疫4周龄的仔猪检测其免疫原性。结果表明，该重组病毒能诱导明显的抗PRV和PCV2体液免疫反应，并且在试验的第49天能够检测到PCV2特异性的淋巴细胞增值反应。Liu等成功构建了融合表达PCV2 ORF2基因与猪IFN-γ基因的重组腺病毒rAd-ORF2-IFN-γ，并证实rAd-ORF2-IFN-γ在小鼠体内诱导产生PCV2特异性抗体的能力比单独表达Cap蛋白的rAd-ORF2强，表明猪IFN-γ作为细胞因子佐剂可以显著增强Cap的免疫原性。Pei等在PRRSV cDNA克隆的ORFs1b与2a插入两个限制性酶切位点及一个转录调节序列，将其改造成一个病毒载体，然后将PCV2 ORF2基因插入两个限制性酶切位点间，由插入的转录调节序列启动转录，转染