摘要：本文对近年来引起延边猪突然死亡的主要病毒进行分离鉴定，进而为疫苗的研发奠定基础，通过对致病细菌培养、细菌形态学观察、细菌培养特性鉴定、细菌生化鉴定、动物接种以及药敏试验的方法对延边猪巴氏杆进行分离培养与鉴定。试验结果表明该病菌于厌氧条件在兔鲜血琼脂平板生长状态良好；革兰氏染色呈阳性，镜检呈圆形、链状；甲基红试验呈红色；能够产生H2S气体；药敏试验该菌株对阿莫西林和先锋V高度敏感。从疑似发生延边猪巴氏杆菌病患猪的肺脏和淋巴结中可以分离到巴氏杆菌。

关键词：巴氏杆菌；分离；鉴定

中图分类号： S852 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.06.036

巴氏杆菌的种类繁多，在自然界分布很广，呈圆形或椭圆形排列成长短不一的链，其易感动物较多，动物巴氏杆菌病中以猪、牛、羊、马较常见。近年来，水貂、鱼、兔、熊也有发生巴氏杆菌病的报道。巴氏杆菌病是由β溶血性巴氏杆菌引起的多种人兽共患病的总称。根据患病猪的临床症状和发病机理不同，可以看出它是感染的巴氏杆菌的种类不一样，所以分为脑膜炎型、关节肿胀型、化脓性淤血淋巴结炎型，还有败血症型[1]。随着经济发展，人们对养殖业的热衷，延边猪患有巴氏杆菌病死亡数也在增加。2014年3月，吉林省某养殖场延边猪死亡，延边猪由于疾病导致死亡的问题引起大家的重视，所以本实验通过细菌培养、细菌形态学观察、细菌培养特性鉴定、细菌生化鉴定、动物接种以及药敏试验的方法对延边猪巴氏杆菌进行分离与鉴定。

1材料与方法

1.1 主要试剂和实验动物

麦康凯琼脂平板、血琼脂平板和普通琼脂平板均自行配制；革兰氏染色试剂和药敏试纸购自福州富利达生物实验制品有限公司，生化试剂购自广东环凯微生物科技有限公司；小鼠购自长春。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 将患病解剖，观察，取样，然后将猪的脾、肺淋巴结等组织进行划线，接种于血清LB平板做细菌分离培养和组织触片检查，置37 ℃厌氧培养20～24小时后在试验台上观察结果，挑取多个单个被怀疑是巴氏杆菌的菌落做纯净的培养。

1.2.2 单个细菌形态外貌及生长特性的观察 将上述已经分离纯化生长非常好的单个菌株一类接种于普通琼脂平板，另一类接种于麦康凯琼脂平板，将它们分别置于37℃有氧和无氧条件下进行单独培养，然后观察他们的生长表现和形态状况等[2]。与此同时对这些菌株的温度、时间、培养的环境、营养需求分别与空白组进行对比试验[3]。然后挑取液体和固体培养基中的菌进行涂片，染色，镜检及进一步观察。

1.2.3 细菌生化鉴定 根据生化鉴定使用说明书，按照步骤将细菌分别接种到葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇生化鉴定管中，37 ℃培养8～24小时后观察结果。做甲基红实验、硫化氢（H2S）实验、过氧化酶实验鉴定巴氏杆菌。

1.2.4动物接种试验 随机选用无菌饲养小鼠8只，设置试验组和对照组，各4只。试验组，分别在小鼠腹腔接种不同梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4）菌液0.5毫升，对照组用灭菌生理盐水代替。并将两组小鼠在相同的环境条件，隔离观察饲养，24小时后观察小鼠发病或死亡的表现，同时剖检致病小鼠，取小鼠内脏进行病原菌的分离培养鉴定与分析。药敏试验操作步骤按常规试纸片法进行。

2 结果

2.1 细菌形态学观察

从小鼠的脾脏中分离得到1 株病原菌，在兔鲜血琼脂平板上厌氧培养18～24小时后进行观察，菌落呈现针尖大小、椭圆形或圆形、局部有隆起、边缘整齐，颜色为灰白色或微灰色；呈革兰氏染色阳性，显微镜下呈圆形的链条形状菌体。

2.2 细菌培养特征鉴定

鉴定结果表明，该菌在麦康凯琼脂平板上置于厌氧和有氧条件下均不生长，在普通琼脂平板上几乎无菌体生长，在有兔鲜血琼脂平板置于厌氧环境培养时，生长状态良好，置于有氧条件下生长状态不好。挑取单个生长菌落分别进行涂片观察，结果显示，革兰氏染色后镜检，均呈阳性、圆形或椭圆形，长、短链形状呈现不均一排列。

2.3 细菌生化鉴定

接种7种生化试剂后发现，该菌不发酵乳糖、葡萄糖、鼠李糖，发酵麦芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇。

甲基红实验，使用甲基红试剂，培养液变成红色。

硫化氢（H2S），使用实验醋酸铅斜面培养基，在穿刺线周围出现黑色。

过氧化酶实验，使用H2O2，有气泡产生。

2.4动物实验病原菌

接种小鼠后，小鼠出现了不同程度的抑郁，食欲不振，精神萎靡等症状， 12小时过后小鼠全部死亡，然后对小鼠剖检，观察到肝脏明显肥大。

2.5药敏试验

该试验结果进一步表明，分离菌株对阿莫西林和先锋V 药物高度敏感，而对菌必治、呋喃妥因、庆大霉素和磺胺类药中度敏感，对青霉素、链霉素、卡那霉素、蒽诺沙星、复方新诺明、环丙沙星不敏感。

3 讨论

依据菌体感染小鼠内脏的分析与鉴定结果，以及延边猪场近期该病的感染状况等，最终将该猪场发生的疫病定为巴氏杆菌感染。该致病菌在有氧和厌氧条件下，在麦康凯琼脂平板上均不生长，在普通琼脂平板上生长极少，而在厌氧比有氧条件下，在鲜血琼脂平板上生长状态非常好。挑取单个生长菌落涂片，革兰氏染色后镜检，均呈巴氏杆菌阳性，形态呈圆形，并呈长短链状排列。

分离获得的菌株对先锋V和阿莫西林均高度敏感，对呋喃妥因、磺胺类药和菌必治等中度敏感，对复方新诺明、链霉素、青霉素、卡那霉素、环丙沙星类药物等极不敏感。

对于此现象，要加强管理，及时消毒，全面做好免疫工作，做好疾病防控。

参考文献

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].北京：中国农业出版社，2006：155-162.

[2] 陆承平.兽医微生物学[M]北京：中国农业出版社，2007.

[3] 倪宏波， 王兴龙.长春地区猪巴氏杆菌分离株的病原特性研究[ J] .黑龙江八一农垦大学学报， 2002， 14（1）：64-76.

作者简介：张闯，硕士，延边大学农学院兽医预防实验室，研究方向：动物传染病分子生物学。endprint