孙菲菲，李春雪，范桂枝

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150040）

筋骨草属（Aj uga）植物属一年生、两年生或多年生草本植物，约有40～50种［1］，在我国境内，筋骨草属植物主要有18种，主要分布在秦岭的南部［2］。筋骨草是一种富含甾酮和生物碱等多种活性物质的药用植物，其生物活性物质具有抗菌［3］、抗肿瘤［4］、抗HIV［5］等重要作用。目前，对筋骨草属中植物源蜕皮激素的应用研究主要集中在昆虫和医药领域。在昆虫上主要用于开发生长调节剂和植物源杀虫剂，其原理是干扰和破坏昆虫的生长、影响蜕皮和使成虫不育［6－7］；在医药上发挥清热解毒、凉血平肝的作用，治疗肝炎、阑尾炎、乳腺炎、急性结膜炎、高血压等，并已开发出主治急、慢性支气管炎的筋骨草胶囊［8－12］。因此，来源于筋骨草属的植物源蜕皮激素必将逐步受到研究者的重视。

次生代谢产物的低产现象是制约天然产物大规模产业化应用的核心问题之一，理解和掌握次生代谢调控规律是解决这一问题的基础。虽然国内外研究者针对次生代谢产物低产问题进行了研究，包括细胞系的优选、培养条件的优化、培养技术的改进以及活性物质合成关键酶基因的克隆等［13－15］。但到目前为止，植物细胞中次生代谢产物的低产问题仍未得到很好解决。次生代谢产物的生物合成容易受外界因素的影响，而细胞内部的信号转导系统是介导外界因子诱发植物次生代谢产物合成的桥梁和纽带［16］，因此寻找有效促进次生代谢产物积累的诱导子、并探讨植物细胞中与次生代谢产物合成有关的信号转导机制，将有助于揭示植物次生代谢的调控机制，对解决植物细胞次生代谢产物低产问题具有重要的理论和实践意义。

一氧化碳（Carbon Monoxide，CO）一直被人们视作有毒气体，因其会与体内血红蛋白或某些酶类的含铁血红素基团结合引发机体中毒。直到上世纪90年代，随着CO 生物学功能进一步被揭示，CO 才开始受到关注。最新研究表明，CO 也是一种重要的细胞信使分子，在细胞功能和通讯调节中发挥重要的信号作用。在植物中的研究发现，CO 具有促进种子萌发和提高植物抗逆反应等生理作用，同时对根的发生、气孔运动及细胞衰老进行调节［17－18］。然而，CO 与次生代谢产物的关系还未见报道。

因此，本研究以产β－蜕皮甾酮的筋骨草愈伤组织为材料，首先从多花筋骨草（Aj uga multif lor a Bunge）和匐枝筋骨草（A．lobata）中筛选β－蜕皮甾酮含量高的品系进行悬浮培养，其次分析了CO 对β－蜕皮甾酮合成的调控作用。期望明确CO 与次生代谢产物的关系，找到同时促进细胞生长和次生代谢产物积累的新诱导子，为解决植物细胞培养生产次生代谢产物中的低产问题提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1．1 研究材料

多花筋骨草和匐枝筋骨草无菌组织培养植株均由东北林业大学森林生物工程实验室提供。研究所用药品均为国产分析纯。

1．2 研究方法

1．2．1 高产β－蜕皮甾酮愈伤组织的筛选 参照黎昕等［19］和马欣等［20］的方法培养筋骨草的愈伤组织，使用MS 固体培养基，附加0．4 mg·L－12，4－dichlorophenoxyacetic acid（2，4－D），对多花筋骨草和匐枝筋骨草无菌组织培养植株根与叶片分别进行愈伤组织诱导，培养期间继代3次以获得稳定生长的愈伤组织。将获得的愈伤组织以1 g·瓶－1的接种量接种于100 mL MS固体培养基中，分别于第7、14、21和28天时以每皿为单位取样进行干重及β－蜕皮甾酮含量的测定，筛选最优品系，组织培养各个时间均为3次重复。

1．2．2 高产β－蜕皮甾酮愈伤组织悬浮体系的建立 将筛选获得的优良品系愈伤组织以8 g·瓶－1接种于100 mL MS液体培养基中进行悬浮培养，获得稳定生长的悬浮细胞。分别在培养3、6、9、12、15、18、21和24 d以每瓶为单位取样，测定干重及β－蜕皮甾酮含量，组织培养各个时间均为3次重复。

1．2．3 外源CO 处理对悬浮细胞影响的研究 将悬浮细胞以鲜重12 g·瓶－1接种于100 mL MS液体培养基中，培养到第8天时，添加CO 供体氯高铁血红素溶液，其终浓度分别为：20、16、12、8 和0 μmol·L－1。处理后于0．5、1、2、4和8 d分别取样测定细胞干重及β－蜕皮甾酮含量，组织处理各浓度和时间均为3次重复。

1．2．4 β－蜕皮甾酮的提取及检测 参照蔡晓明等［21］筋骨草甾醇提取法经优化获得β－蜕皮甾酮的超声微波醇提法：将筋骨草愈伤或悬浮细胞放入60℃烘箱至恒重，研磨成粉末状，每个样品准确称取0．2 g置于10 mL 离心管中，加入5 mL 色谱甲醇，超声（10 k Hz）提取40 min，浸提过夜，再超声（10 k Hz）提取40 min，在50 ℃、2 at m、300 W 的条件下微波消解提取10 min，过滤膜（0．45μm），待测。

参照张留记等［22］β－蜕皮甾酮高效液相色谱法并优化色谱条件：色谱柱Hi Q sil C18 V 4．6 mm×250 mm，流动相甲醇（甲醇∶水＝1∶1），检测波长242 n m，流速0．8 mL·min－1，柱温30 ℃，进样体积20μL。

以β－蜕皮甾酮标准品做标准曲线定量，在0．08～0．4 mg·mL－1范围内线性关系良好，回归方程为Y＝2E－08 X－0．002 9（R2＝0．998 6）。

1．2．5 数据处理 所有数据是3次独立重复试验结果的平均值和标准偏差，选用SPSS 19．0软件进行数据统计分析，选择Duncan 法进行多重比较，P＜0．05，利用Origin 8．0制图。

2 结果与分析

2．1 高产β－蜕皮甾酮的愈伤组织筛选

一个培养周期内，多花筋骨草和匍枝筋骨草根、叶诱导的愈伤组织的干重积累量呈增加趋势（图1 A），且均在第28天达到最高值。研究发现，不同品种及部位的筋骨草愈伤组织在培养7 d时，干重无显著差异（P＞0．05），而在14 d时，匐枝筋骨草根和叶诱导的愈伤组织干重均显著高于多花筋骨草（P＜0．05），其中根的干重在第28天时最大，达到8．1 g·L－1。

匐枝筋骨草愈伤组织中β－蜕皮甾酮含量的变化趋势与干重积累基本一致，而多花筋骨草愈伤组织中基本上检测不到β－蜕皮甾酮（图1B）。其中，匐枝筋骨草根诱导的愈伤组织中β－蜕皮甾酮含量同样在第28天时达到最大值（0．61 mg·g－1）。另外，愈伤组织培养到第7天，4种愈伤组织中均检测不到β－蜕皮甾酮的积累，说明愈伤组织生长初期合成β－蜕皮甾酮的含量极低，高效液相水平没有检测到。

通过比较4种愈伤组织干重积累量及β－蜕皮甾酮含量的变化发现，匐枝筋骨草根诱导的愈伤组织在干重和β－蜕皮甾酮含量上的积累均较高。因此，以下研究选用匐枝筋骨草根诱导的愈伤组织作为研究材料。

2．2 高产β－蜕皮甾酮愈伤组织的悬浮培养

在一个培养周期内，愈伤组织悬浮细胞的干重呈增长趋势（图2 A）。其中，在培养的12～15 d，干重积累显著增加（P＜0．05）。由此可知，匐枝筋骨草悬浮细胞在培养的12～15 d期间细胞生长最快。同时，分析悬浮细胞中的β－蜕皮甾酮含量发现，在培养的9～15 d中，β－蜕皮甾酮含量迅速增加，在第15天时，β－蜕皮甾酮含量达到最大，为0．99 mg·g－1，

图1 不同筋骨草组织诱导愈伤干重及β－蜕皮甾酮测定Fig．1 The deter mination of dry weight andβ－ecdysterone in different Aj uga lobata callus tissue

此后随着培养时间的延长β－蜕皮甾酮含量开始逐渐下降，当培养到第24天时，细胞已经开始褐化死亡，因此未测定β－蜕皮甾酮含量（图2B）。

2．3 外源CO 处理对筋骨草悬浮细胞干重和β－蜕皮甾酮积累的影响

为了探究外源CO 处理对筋骨草悬浮细胞中β－蜕 皮 甾 酮 积 累 的 影 响，将8、12、16 和20 μmol·L－1的氯高铁血红素溶液分别处理培养8 d的悬浮细胞，分析其干重和β－蜕皮甾酮的积累量。研究发现，不同浓度及时间的处理，对细胞干重有着不同的影响，其中，8μmol·L－1处理8 d时，干重积累达最大值（图3 A），为对照组的1．09倍。同时，过高的CO 浓度及过长的处理时间（20μmol·L－1，8 d）会对悬浮细胞的干重产生显著抑制（P＜0．05）。外源CO 处理后悬浮细胞中β－蜕皮甾酮的积累量同样发生变化，在处理第4天时，β－蜕皮甾酮含量较对照均显著提高（P ＜0．05）（图3 B）。其中，8 μmol·L－1处理时β－蜕皮甾酮含量为对照组的1．3倍，12μmol·L－1处理时为对照组的1．5倍。当处理到第8天时，低浓度的CO 处理（8μmol·L－1）使β－蜕皮甾酮的积累量提高了80．82%，但其余高浓度处理的悬浮细胞中β－蜕皮甾酮含量显著低于对照组（P＜0．05），分别比对照组降低了47．80%、66．00%和67．56%。因此，低浓度的氯高铁血红素溶液对悬浮细胞β－蜕皮甾酮的合成具有促进作用，而过高的处理浓度及过长的处理时间对β－蜕皮甾酮的积累产生了抑制作用。

图2 匐枝筋骨草根诱导愈伤组织悬浮细胞干重及β－蜕皮甾酮测定Fig．2 The deter mination of dry weight and β－ecdysterone in Aj uga lobata suspension cells

3 讨论

图3 不同浓度氯高铁血红素处理匐枝筋骨草根悬浮细胞干重及β－蜕皮甾酮含量Fig．3 The deter mination of dry weight andβ－ecdyster one in Aj uga lobata suspension cells treated with different concentrations of hemin

外植体是影响愈伤组织诱导的因素之一，各种外植体诱导形成愈伤组织的难易与本身的生理生化状态密切相关，也有研究发现不同外植体诱导的愈伤组织中次生代谢物种类和含量也不同，例如虎杖（Pol ygonu m cuspidatum）愈伤组织诱导时茎段比叶片和叶柄诱导效率高且次生代谢物大黄素含量也较高［23］。同时，本研究发现，多花筋骨草和匐枝筋骨草根和叶诱导愈伤组织中β－蜕皮甾酮积累量也不同，其中匐枝筋骨草根诱导的愈伤组织在干重和β－蜕皮甾酮含量上的积累均较高。对于β－蜕皮甾酮含量较高的露水草（Cyanotis ar achnoides）植株根中β－蜕皮甾酮含量较高，通常在2．08%～3．10%，地上部分的含量则均在1．0%以下［24］，这与本研究结论相同。β－蜕皮甾酮的积累具有组织特异性，这可能与其功能存在着密切的联系。β－蜕皮甾酮具有类似植物激素的生物活性，调控植物的生长发育，同时保护植物免受昆虫侵害［15］，因此其在根中的高含量可能与保护植株有关，但其机制还需要进一步研究。

为了探究外源CO 处理对β－蜕皮甾酮含量积累的作用，本研究将不同浓度的CO 供体氯高铁血红素溶液添加到匐枝筋骨草根诱导的悬浮培养体系中，发现低浓度（8μmol·L－1）外源CO 促进了β－蜕皮甾酮的积累量，而高浓度外源CO 及过长的处理时间（16及20μmol·L－1，8 d）对匐枝筋骨草悬浮细胞干重及β－蜕皮甾酮含量的积累产生了明显的抑制作用。有研究表明，气体信号分子对植物的影响具有双重性，过高的气体信号分子浓度会引发自由基链式反应，造成细胞损伤［25］，这可能是引起β－蜕皮甾酮含量降低的一个重要因素。

β－蜕皮甾酮等次生代谢产物是植物长期演化中形成的一种对环境适应机制，构成了植物防卫和抗逆系统的一个重要组成部分。目前，气体信号分子NO 调控植物次生代谢产物中的信号功能已被证实［26］，而新型信号分子CO 与次生代谢产物的关系本研究才初步证实，证明CO 可以促进次生代谢物的积累，而其调控次生代谢产物合成的机制还不清楚，这也是下一步研究的主要内容。

4 结论

通过分析多花筋骨草和匐枝筋骨草根和叶诱导愈伤组织中β－蜕皮甾酮的含量，发现匐枝筋骨草根诱导的愈伤组织中β－蜕皮甾酮积累量最高。并对其进行外源CO 处理结果显示，低浓度（8μmol·L－1）外源CO 处理促进了β－蜕皮甾酮的积累量，而过高浓度及过长的处理时间（16及20μmol·L－1，8 d）却产生抑制作用。

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