赵丹丹， 徐 慧， 彭剑雄

(中南大学 湘雅医学院医学检验系， 长沙 410013)

端粒延长过程影响因素研究新进展

赵丹丹， 徐 慧， 彭剑雄

(中南大学 湘雅医学院医学检验系， 长沙 410013)

端粒作为染色体的保护结构，在维持染色体稳定和结构完整上起着重要作用。而端粒酶具有过延长端粒的功能，是维持端粒长度的重要酶复合体。端粒酶延长端粒的过程是一个涉及多种因子多个环节的复杂过程。主要涉及端粒自身结构相关调节以及端粒酶相关的调节。端粒酶相关调节是调节系统中最重要的组成部分。包括TR自身结构的影响，调节因子对TERT启动子的调节等。

端粒;端粒酶;GQ;TPP1/POT1;TERRA;hTR;hTERT

端粒是位于真核细胞染色体末端的“帽子”结构，其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。随着细胞的分裂，端粒会不断缩短直至危急长度。端粒的不断缩短可以导致3种结果：细胞衰老，凋亡，携带不稳定基因继续分裂。端粒酶对端粒长度的维持是极为重要的。端粒酶延长端粒是一个涉及多因子，多水平的复杂过程，并受到多方面因素的调节，其中主要包括端粒的自身结构的影响，端粒酶的相关调节以及DNA损伤修复系统的相关调节。端粒或端粒酶异常与肿瘤的发生发展，DNA的损伤修复均有着密切关系。因此，了解端粒延长过程的影响因素能够为以端粒，端粒酶为靶点的药物研究及治疗策略提供理论基础和研究方向。

1 端粒自身结构的影响

1.1 GQ结构的影响

G-四联体(G-quadruplex，GQ)是端粒3′单链悬突形成的堆叠结构，可以保护染色体末端的稳定性。在复制过程中，如果端粒末端的这种GQ空间结构不能被有效打开会阻碍复制叉的移动，进而阻碍端粒末端的复制[1]。在染色体末端的延长及保护机制中，GQ对多种酶也都有调节作用，包括端粒酶。GQ可以通过加强端粒保护蛋白1(protection of telomere1，POT1)/ 三肽基肽酶Ⅰ(Tripeptidyl-peptidase 1，TPP1)对单链端粒DNA(single-stranded telomeric DNA，ssTEL)的竞争结合作用从而阻碍端粒酶延长端粒。POT1/TPP1对折叠或非折叠的GQ结构均有竞争结合作用。在折叠的GQ结构中，TOP1可以与其临近的序列结合，从而阻止复制蛋白A(ReplicationproteinA,RPA)的结合。而在打开的GQ结构中，POT1则通过包裹ssTEL阻碍RPA的结合[2]。

1.2 TPP1/POT1相关调节

POT1是端粒延长过程中端粒酶依赖的激活或抑制因子，而TPP1正是通过影响POT1的募集状态，在端粒的延长过程中发挥调节作用。此外，TPP1通过提高端粒酶的持续合成能力提高延长效率。POT1-TPP1与引物结合，可以降低引物解离率并提高引物-模板移位效率，增加端粒酶与端粒的循环结合次数，从而提高端粒酶的持续合成能力[3]。RNA模板与引物的配对数目也会影响端粒酶的持续合成能力。增加引物与RNA模板临近区的配对长度可以增加端粒酶与端粒的循环结合次数[4]。另外，研究发现TPP1-POT1二聚体对ssDNA的亲和力要比单独TOP1的亲和力高[5]。TPP1-POT1还可以结合于端粒酶持续延长抑制位点，阻止抑制因子的干扰。

1.3 TERRA调节

TERRA是端粒转录的一段长的无编码RNA，通过与TR模板碱基互补配对从而抑制端粒酶延长端粒的作用[6]。另外，它还可以通过与人异质性胞核核糖核蛋白A1(hnRNPA1)的相互作用进而阻碍端粒酶对端粒的延长。hnRNPA1通过与TERRA的结合可以释放3′悬突末端[7]，促进RPA募集到端粒末端，从而完成RPA与POT1/TPP1的转换。但研究发现，当hnRNPA1过表达却会通过与端粒末端的引物区结合的方式抑制端粒酶的功能。因此，hnRNPA1与TERRA的平衡对端粒酶的功能有着重要影响。MRE11是作用于端粒3′G悬突末端的一种核酸酶。赖氨酸特异性去甲基酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)与MRE11相互作用可以激活MRE11核酸酶活性，分解裸露状态的端粒3′G悬突末端。并且随着TERRA水平的升高，LSD1对MRE11的作用会进一步加强[8]。

2 端粒酶的相关调节

2.1 hTR的相关调节

哺乳动物端粒酶RNA(telomerase RNA, TR)二级结构包含几个高度保守结构域：模板区(CR1)，假结区(CR2/CR3)[9]，反式激活模序(CR4/CR5), CR6/CR7区(H/ACA模序)。CR2/CR3易于结合抑制性寡核苷酸，封闭CR2/CR3可以有效抑制端粒酶活性。H/ACA 3′末端环的顶端包含Cajal盒(CAB)模序[10]，在TCAB1(端粒酶Cajal小体蛋白1)介导下与Cajal结合，使其局限于小体内[11]。在小体内端粒酶RNP可以整套传递到端粒上，在端粒延长过程中起着重要作用。CR4/5是由3个螺旋结构的茎/茎环组成的Y字形结构，对端粒酶的激活有着重要作用。在青鳉鱼的研究中发现，在与TERT结合的过程，CR4/5内部的这种链接方式可以提供一个灵活的支架，用于改变其空间构象以便更好地与TERT结合[12]。其中P6.1对TERT的结合和端粒酶的活性的作用最为重要。值得注意的是P6.1的茎空间构象而非茎碱基序列在TERT的结合及端粒酶的活性中起着重要作用[12]。近来，在酵母的研究中又发现了一个新的功能区TeSS，此区也具有保守性，位于茎-环IVc的末端。TeSS通过与Est2和Est3相互作用，使其稳定的作用于假结区或模板区，从而在端粒酶的激活及全酶作用的发挥过程中发挥关键作用[13]。

2.2 TERT的相关调节

端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase , TERT)转录水平对酶活性的调节是至关重要的，而hTERT启动子则是端粒酶的调节机制中的重要位置。据报道，在多种肿瘤细胞中hTERT启动子的热突变点为C228T 和C250T[14-16]。hTERT启动子的甲基化也能上调hTERT的表达，已经发现在多种肿瘤细胞中TERT CpG岛的甲基化能够提高TERT的表达水平[17]。TERT调节方式主要有以下几种。

2.2.1 肿瘤抑制因子的调节作用。p53、p63TAα、p63TAy、p73α和p73β为肿瘤抑制因子p53家族成员。这些肿瘤抑制因子通过不同的途径抑制启动子的转录，对于hTERT的转录水平上的调节上都有着重要意义。最近研究发现，p53介导的抑制作用并不依赖于SP1，而是通过下调c-myc表达或者依赖E-盒/E2F途径来调节hTERT的表达水平[18]。p63Taα是唯一一个依赖于SP1发挥抑制作用的因子，p63Taα通过与SP1结合，阻碍SP1与hTERT启动子上的SP1结合位点[18]。p63TAγ介导的抑制作用完全依赖于E2F位点，诱导E2F突变能有效地抑制p63TAγ介导的hTERT启动子抑制作用。p73α和p73β介导的抑制作用不依赖于SP1，E盒和E2F位点，而是受核酸因子Y 亚基(Nuclear Factor Y subunits，NF-YB)的调节。p73β对hTERT的抑制作用依赖于NF-YB2，而NF-YB1和NF-YB2共同调节p73α的抑制作用。

2.2.2 MYC相关途径。MYC通过与TERT-34位E盒结合激活TERT，上调TERTmRNA表达水平。在免疫生发中心，近成熟的B细胞或培养的T细胞也可以通过MYC增加TERTmRNA表达量来激活酶活性。由于MYC是SRC，YES和FYN激酶的下游靶基因。所以在T/B细胞激活的早期其表达水平就已上调，再由MYC作用于TERT的启动子区，从而激活端粒酶。c-myc/max与Mnt/max作用相反，体内通过两者间的平衡来调节hTERT的转录水平。c-myc与E盒结合后通过改变hTERT启动子处染色体的构象，增加染色体DNA的可接近性，并诱导H3K9，H4K16的乙酰化从而促进hTERT的转录。而Mnt作用则相反，Mnt通过与c-myc竞争性结合E盒，Mnt与E位结合后改变启动子所在区段染色体构型增加其密度，并诱导H3K9，H4K16的去乙酰化，从而抑制转录[19]。

2.2.3 HPV-E6相关途径。HPV-E6可以通过组蛋白的乙酰化与二甲基化改变构象，并且可以在转录后水平上上调MYC，从而调节TERT表达。同时E6也可以与多种转录调节因子作用影响转录。Maz和Foxc1为新发现的转录抑制因子。Maz可以结合到TERT的启动子上，从而抑制转录过程。并且两者均可通过组蛋白的乙酰化及染色体构型的改变来调节转录过程。E6的表达可以阻碍Maz与启动子的结合，同时增加Sp1与启动子的结合，提高转录效率[20]。研究表明，敲除Maz可以进一步增加H3K9、H4K16的乙酰化，并在E6存在而情况下增加hTERT的表达。NFX1-91是另一种新发现的转录抑制因子。NFX1-91可以通过与HDAC发生作用，从而维持基因的抑制状态。而E6与E6AP相互作用可以促进NFX1-91的降解，从而解除组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的作用，促进hTERT的转录[20]。因此，E6通过与转录因子的作用，降解转录因子，改变染色体构象等方式促进端粒酶的转录过程。

3 DNA损伤修复相关调节

细胞DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)系统对稳定端粒结构和功能有重要作用。Metcalfe等发现ATM遗传性突变的AT患者体细胞端粒长度缩短加速，并且染色体末端融合频率升高。更有研究发现在cdc9-1细胞中激活DNA损伤信号会导致端粒的增长。DDR可以通过抑制端粒酶活性的方式影响端粒长度，也可以直接作用于端粒。由于端粒酶不仅能在端粒末端延长，也能在非端粒末端延长，如BSR[21]。为了防止端粒酶的错误延长，在DNA损伤细胞中，Pif1通过发生磷酸化抑制端粒酶的活性。ATM和ATB是DDR中两种重要激酶，而两者与端粒均有生理性结合，抑制ATM和ATB都能导致端粒长度的变化和染色体末端的融合。另外，多种参与DDR的蛋白因子对端粒的稳定性也有重要影响，如Ku[22]、MRN蛋白复合体等。双链损伤修复(double-strand break repair，BSR)主要有两种方式，一是同源重组，一是诱导损伤复制(break induced replication ，BIR)，两种途径均会导致端粒延长。BIR需要功能性端粒酶，核心DNA损伤信号途径Mec1-Rad9-Rad53，BIR 修复途径成分Rad51、Rad52、Pol32和Pif1。Mec1-Rad53介导Pif1的磷酸化，此过程对于双链损伤中端粒酶的抑制，BIR中Pif1功能的发挥，以及cdc9-1 细胞中端粒的延长均有着重要作用[23]。

4 结束语

端粒的延长是一个涉及多因子多水平的复杂过程。多种调节因子相互关联，相互影响形成一个复杂而庞大的调控体系。无论是端粒自身结构的影响，还是端粒酶相关的调节都对体内端粒DNA长度的维持有着重要意义。端粒调节系统的失衡是导致相关疾病发生的根本原因。尤其在DNA损伤与修复中，端粒的作用越来越受到重视。因此，对此过程中调节因子及调节因子间的相互作用的深入研究，不仅有助于我们更加彻底的了解端粒、端粒酶，更能为端粒相关疾病提供更多的诊断方法和治疗策略。

[1]Novo C L, Londono-Vallejo J A. Telomeres and the nucleus[J]. Semin Cancer Biol, 2013, 23(2): 116-124.

[2]Ray S, Qureshi M H, Malcolm D W, et al. RPA-mediated unfolding of systematically varying G-quadruplex structures[J]. Biophys J, 2013, 104(10): 2235-2245.

[3]Latrick C M, Cech T R. POT1-TPP1 enhances telomerase processivity by slowing primer dissociation and aiding translocation[J]. EMBO J, 2010, 29(5): 924-933.

[4]Chen L Y, Majerska J, Lingner J. Molecular basis of telomere syndrome caused by CTC1 mutations[J]. Genes Dev, 2013, 27(19): 2099-2108.

[5]Nandakumar J, Bell C F, Weidenfeld I, et al. The TEL patch of telomere protein TPP1 mediates telomerase recruitment and processivity[J]. Nature, 2012, 492(7428): 285-289.

[6]Cusanelli E, Chartrand P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2014, 5(3): 407-419.

[7]Redon S, Zemp I, Lingner J. A three-state model for the regulation of telomerase by TERRA and hnRNPA1[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(19): 9117-9128.

[8]Porro A, Feuerhahn S, Lingner J. TERRA-reinforced association of LSD1 with MRE11 promotes processing of uncapped telomeres[J]. Cell Rep, 2014, 6(4): 765-776.

[9]Martinez P, Blasco M A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(3): 161-176.

[10]Gupta S K, Kolet L, Doniger T, et al. The trypanosoma brucei telomerase RNA (TER) homologue binds core proteins of the C/D snoRNA family[J]. FEBS Lett, 2013, 587(9): 1399-1404.

[11]Her J, Chung I K. The AAA-ATPase NVL2 is a telomerase component essential for holoenzyme assembly[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417(3): 1086-1092.

[12]Kim N K, Zhang Q, Feigon J. Structure and sequence elements of the CR4/5 domain of medaka telomerase RNA important for telomerase function[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(5): 3395-3408.

[13]Laterreur N, Eschbach S H, Lafontaine D A, et al. A new telomerase RNA element that is critical for telomere elongation[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(16): 7713-7724.

[14]Arita H, Narita Y, Fukushima S, et al. Upregulating mutations in the TERT promoter commonly occur in adult malignant gliomas and are strongly associated with total 1p19q loss[J]. Acta Neuropathol, 2013, 126(2): 267-276.

[15]Huang F W, Hodis E, Xu M J, et al. Highly recurrent TERT promoter mutations in human melanoma[J]. Science, 2013, 339(6122): 957-959.

[16]Nault J C, Mallet M, Pilati C, et al. High frequency of telomerase reverse-transcriptase promoter somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions[J]. Nat Commun, 2013(4): 2218.

[17]De Wilde J, Kooter J M, Overmeer R M, et al. hTERT promoter activity and CpG methylation in HPV-induced carcinogenesis[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 271.

[18]Yao Y, Bellon M, Shelton S N, et al. Tumor suppressors p53, p63TAalpha, p63TAy, p73alpha, and p73beta use distinct pathways to repress telomerase expression[J]. J Biol Chem, 2012, 287(24): 20737-20747.

[19]Wahlstrom T, Belikov S, Arsenian H M. Chromatin dynamics at the hTERT promoter during transcriptional activation and repression by c-Myc and Mnt in Xenopus leavis oocytes[J]. Exp Cell Res, 2013, 319(20): 3160-3169.

[20]Xu M, Katzenellenbogen R A, Grandori C, et al. An unbiased in vivo screen reveals multiple transcription factors that control HPV E6-regulated hTERT in keratinocytes[J]. Virology, 2013, 446(1/2): 17-24.

[21]Doksani Y, de Lange T. The role of double-strand break repair pathways at functional and dysfunctional telomeres[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014, 6(12): a16576.

[22]de Sena-Tomas C, Yu E Y, Calzada A, et al. Fungal Ku prevents permanent cell cycle arrest by suppressing DNA damage signaling at telomeres[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43(4): 2138-2151.

[23]Vasianovich Y, Harrington L A, Makovets S. Break-induced replication requires DNA damage-induced phosphorylation of Pif1 and leads to telomere lengthening[J]. PLoS Genet, 2014, 10(10): e1004679.

Progress in effecting factors on telomere elongated process

ZHAO Dan-dan, XU Hui, PENG Jian-xiong

(Department of Clinical Laboratory Medicine, Xiangya Medical College, Central South University, Changsha 410013, China)

As the protection of the chromosome structure, telomere plays an important role in maintaining the stability and structural integrity of chromosomes. The telomerase is one of the important enzymes maintaining telomere length, and telomere elongated process is a complicated process involving a variety of factors, mainly related to telomere structure and telomerase regulation. The telomerase related regulation is the most important part of the control system, including the influence of TR structure, regulation on TERT promoter etc.

telomere; telomerase; GQ; TPP1/POT1; TERRA; hTR; hTERT

2015-01-16；

2015-02-13

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(CY14277)

赵丹丹，硕士研究生，研究方向为临床生物化学和分子诊断；

彭剑雄，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为临床生物化学和分子诊断，E-mail: jxpeng@csu.edu.cn。

R394.8

A

2095-1736(2015)05-0089-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.089