兰蓉，李双石，辛秀兰

（北京电子科技职业学院，北京100029）

葡萄糖氧化酶对蓝莓酒贮藏过程中香气成分的影响

兰蓉，李双石，辛秀兰*

（北京电子科技职业学院，北京100029）

以树莓酒为试材，分别以3种方式（葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理、葡萄糖氧化酶单独处理、葡萄糖氧化酶和焦亚硫酸钠联合处理）处理，以无菌蒸馏水处理为对照，4℃下贮藏6个月后，采用顶空固相微萃取（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）分析了蓝莓酒香气成分的变化。结果表明：3种不同方式处理的蓝莓酒，在香气物质总量、酯类成分含量、对果酒香气质量呈正向贡献的典型香气成分的保持效果方面均优于对照组，其中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒保持效果最好，更有益于蓝莓酒的贮藏。

葡萄糖氧化酶；蓝莓酒；香气成分；气相色谱-质谱（GC-MS）

蓝莓（Semen Trigonellae）属于杜鹃花科越橘属，为多年生落叶或常绿灌木或小灌木树种。蓝莓果实含有花青素、黄酮等多种多酚类生理活性成分，使蓝莓果实具有很强的抗氧化性，具有促视红素再合成、改善循环、抗溃疡、抗炎症、提高免疫力、增强心脏功能、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌及抗突变等多种生理活性功能。因此，国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一[1]。近年来，大量学者对蓝莓酒的研制和有效成分分析做了诸多研究[2-5]，对蓝莓果酒香气成分的研究也有少量的研究报道[6]，但对蓝莓酒贮藏过程中香气成分的变化和改良至今少见有研究报道。

果酒是一个复杂的体系，在贮藏过程中其香气成分受酒中成分和贮藏条件等因素的影响可能会发生许多复杂的化学变化。其中氧气是导致果酒在贮藏过程中风味发生显著改变的主要原因之一，氧的存在不会促进陈酿，反而会使氧化还原电位升高，并引起早熟，产生氧化味[7]。

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，简称GOD）是一种天然的食品添加剂，对人体无毒、无副作用，它能够利用氧气将葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效除氧，因而可作为生物去氧剂应用于酒类产品的风味改良[8-11]。本论文采用顶空固相微萃取（SPME）结合气相质谱（GCMS）检测分析葡萄糖氧化酶对蓝莓果酒贮藏过程中香气物质组成的影响，探讨葡萄糖氧化酶对保持蓝莓酒香气及延长保存期的作用，为蓝莓酒的科学贮藏提供理论依据和科学指导，这方面的研究未见有报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓酒：伊春市忠芝大山王酒业有限公司产品；葡萄糖氧化酶：2 000U/g，北京卫诺恩生物技术有限公司；过氧化氢酶：20万U/mL，枣庄市杰诺生物酶有限公司；焦亚硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠：分析纯，天津市华东试剂厂。

1.2 设备

气质联用仪：7890A气相色谱仪、5975质谱仪，Agilent公司；手动固相微萃取（SPME）进样器及100μm PDMS萃取头，美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓酒贮藏前处理

本试验设计了1个对照组和3个实验组，每个组别各取蓝莓酒样150m L进行处理，具体处理方式见表1。对照组和各实验组4℃贮藏6个月后取样进行测定。

1.3.2 蓝莓酒香气成分的顶空固相微萃取

量取蓝莓酒样品15mL置于25mL顶空瓶中，加入2 gNaCl，加盖密封，于45℃水浴中平衡10min；然后将在气相色谱仪的进样口250℃老化1 h后的固相微萃取器插在顶空瓶上，吸附40min后拔出，插入气相色谱仪进样口，于250℃解析5min，同时启动仪器采集数据。

1.3.3 GC-MS分析条件

1.3.3.1 气相色谱条件

DB-Wax弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm× 0.25μm）；程序升温：初始温度60℃，保持5min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至250℃，保持5 min；进样口250℃；传输线250℃；载气：高纯He（99.999%）；载气流速1.0mL/min；不分流进样。

1.3.3.2 质谱条件

电离方式EI，70 eV；离子源温度230℃，质量扫描范围30 amu～500 amu。

2 结果与讨论

2.1 蓝莓酒香气成分的GC-MS分析

采用顶空固相微萃取（SPME）结合气相质谱（GCMS）检测分析了蓝莓原酒和采用3种不同方式处理并贮藏6个月的蓝莓酒香气成分，通过GC-MS自带的NIST08.L库自动检索获得目标组分的初步鉴定结果，再结合相关专业知识和有关文献资料进行人工谱图解析，最终确定各组分的化学名称，采用峰面积归一法对各组分进行定量分析，分析鉴定结果见表2。

从表2可知，蓝莓原酒中共检测出40种香气成分，占总峰面积的97.96%。其中，酯类20种，醇类2种，醛酮类3种，萜烯类5种，烷类4种，萘类4种，其它类2种，分别占香气总量的64.98%、9.89%、10.61%、5.04%、1.3%、3.31%、2.83%。其中柠檬烯为蓝莓原酒中独有的香气成分，在3种贮藏半年的蓝莓酒中均有未检出。有研究认为柠檬烯含量下降，主要是由于在酸性条件下部分柠檬烯通过水合、水解等反应生成α-、β-松油醇[12]。

对照组的蓝莓酒贮藏半年后共检测出40种香气成分，占总峰面积的84.69%，与其他3种处理过的蓝莓酒相比，香气物质总含量最低。其中，酯类18种，醇类4种，醛酮类4种，萜烯类4种，烷类4种，萘类4种，其它类2种，分别占香气总量的56.54%、8.68%、8.93%、2.11%、2.46%、3.17%、2.8%。与原酒相比，不加酶处理的蓝莓酒贮藏6个月后香气物质总量降低了13.27%，其中酯类成分含量下降了8.44%。李建东[13]研究报道，酒中溶解氧是影响酯水解速度的关键性因素，溶解氧加快了酒内酯类的水解速度，从而导致了酯类成分含量的下降，降低了成品酒的品质。

葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒

贮藏半年后共检测出43种香气成分，占总峰面积的94.76%，与其他3种处理蓝莓酒的方法相比，香气物质种类和总含量最高。其中，酯类20种，醇类4种，醛酮类4种，萜烯类4种，烷类4种，萘类4种，其它类3种，分别占香气总量的69.18%、8.3%、8.26%、3.50%、1.47%、1.75%、2.3%。与原酒相比，香气物质总量仅降低了3.2%，而酯类成分含量却增加了4.2%。上述结果与葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的作用机理有关。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢，而产生的过氧化氢是强氧化剂，能使酒中不饱和脂肪酸、酚类物质、高级醇等香气物质在酒的贮存过程中发生氧化和降解，产生羰基化合物和挥发性醛类化合物，造成酒风味的老化。而当使用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的复合酶时，加入的过氧化氢酶能够将葡萄糖氧化酶在氧化过程中产生的过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸，该反应直到葡萄糖或氧消耗尽而终止，从而保护酒中易被氧化的物质，同时由于降低了酒中的氧的浓度，抑制了酯类等香气成分的降解[10]。

葡萄糖氧化酶单独处理的蓝莓酒贮藏6个月后共检测出41种香气成分，占总峰面积的86.69%。其中，酯类19种，醇类3种，醛酮类3种，萜烯类4种，烷类4种，萘类5种，其它类3种，分别占香气总量的58.92%、8.04%、9.03%、2.12%、2.62%、2.98%、2.98%。与原酒相比，香气物质总量降低了11.27%，其中酯类成分含量下降了6.06%。原因如前所述，就是尽管利用葡萄糖氧化酶，可以有效地除去酒中的溶氧，但是同时也会产生过氧化氢，过氧化氢是产生羟基自由基的前体物质，容易造成一些香气成分的降解和氧化，这可能就是为什么用葡萄糖氧化酶单独处理蓝莓酒后，没有较好的保持蓝莓酒香气成分的原因之一。

葡萄糖氧化酶和焦亚硫酸钠联合处理的蓝莓酒贮藏6个月后共检测出40种香气成分，占总峰面积的89.58%。其中，酯类19种，醇类4种，醛酮类4种，萜烯类2种，烷类4种，萘类4种，其它类3种，分别占香气总量的60.71%、6.6%、10.4%、2.34%、2.74%、3.16%、3.63%。与原酒相比，香气物质总量降低了8.65%，其中酯类成分含量下降了4.27%。亚硫酸盐产生的二氧化硫具有去除自由基的作用，可以改善葡萄糖氧化酶脱氧所造成的缺陷[10]。黄惠芝等[11]的试验证明，葡萄糖氧化酶与亚硫酸盐联合使用，去氧效果更好。因此，加葡萄糖氧化酶和焦亚硫酸钠联合处理的蓝莓酒贮藏6个月后，酯类成分总量的下降低于只加葡萄糖氧化酶处理的蓝莓酒。但加葡萄糖氧化酶和焦亚硫酸钠联合处理的蓝莓酒在香气成分总量、种类和酯类物质总量的保持上，效果不如加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒，可能是由于过氧化氢酶能专一性的分解过氧化氢，从而更好地保护酒中的香气成分。

2.2 蓝莓酒贮藏期间典型香气成分的分析

酯类物质可以产生明显的香气。果酒在品尝时，几乎所有的香气都是由酯类物质产生的[14]。本研究中，酯类物质是蓝莓酒中组成种类最多且含量最高的物质。5个蓝莓酒样品中平均含量最高的酯类都是丁二酸二乙酯、辛酸乙酯和己酸乙酯。丁二酸二乙酯具有淡而舒适的葡萄香气；辛酸乙酯具有令人愉快的花果香气、杏子香气；癸酸乙酯具有葡萄的水果香气；己酸乙酯具有强烈的水果香气，并有苹果、菠萝、香蕉样的香气[6]。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒贮藏6个月后3种主要酯类成分都高于其他2种方法处理的蓝莓酒。特别是呈果香型的香气物质己酸乙酯的平均含量是对照组，即不加酶处理的蓝莓酒的1.3倍并略高于蓝莓原酒。

多数醇类具有不愉快的香气，如：α-松油醇等，对果酒的香气质量呈负向贡献。但苯乙醇的香味独特，具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多样风味[15-16]。本研究结果表明，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒贮藏6个月后苯乙醇平均含量是对照组和其他2种方法处理的蓝莓酒的1.55倍以上，而α-松油醇的平均含量则低于对照组和其他2种方法处理的蓝莓酒以及蓝莓原酒，说明葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合除氧有利于提高蓝莓酒的品质。

萜烯类是果酒中的重要的香气物质。这类化合物具有令人愉悦的芳香气味和极低的阈值[17]。有研究[18]认为，由于烯类化合物分子中存在双键，具有不饱和性，容易发生氧化、聚合、异构化和分子重排等反应；随着酒液发酵程度的增强，二氧化碳气体呈沸腾状冲出发酵液面，极易带走挥发性低闪点物质。因而造成萜烯类香味成分在果酒发酵过程中容易丧失或发生变化。本实验也表明，萜烯类香气成分在蓝莓酒贮藏过程中丧失较多，但葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒对萜烯类化合物的保持明显优于对照组和其他2种方法处理的的蓝莓酒，其萜烯类化合物的平均含量是对照组和其他2种方法处理的蓝莓酒的1.5倍以上。

3 结论

采用顶空固相微萃取法，通过GC-MS分析，比较了不加葡萄糖氧化酶处理、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理、葡萄糖氧化酶单独处理、葡萄糖氧化酶和焦亚硫酸钠联合处理并贮藏6个月的蓝莓酒香气成分。研究结果表明，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒中检测到43种香气成分，在4种贮藏6个月的蓝莓酒中，香气物质总量最高，最接近蓝莓原酒，其中酯类成分含量比原酒增加了4.2%，较好地保持了一些对果酒香气质量呈正向贡献的典型香气成分，有益于蓝莓酒的贮藏。葡萄糖氧化酶和焦亚硫酸钠联合处理的蓝莓酒在香气物质总量、酯类成分含量、对果酒香气质量呈正向贡献的典型香气成分3个方面的保持效果不及葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合处理的蓝莓酒，但优于葡萄糖氧化酶单独处理的蓝莓酒，对照组即不加葡萄糖氧化酶处理的蓝莓酒在这3个方面的保持效果最差。

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Effectiveness of Glucose Oxidase on the Aromatic Composition of Blueberry Wine during Storage

LANRong，LIShuang-shi，XINXiu-lan*
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Using blueberry wine as samples，we tested several different glucose oxidase treatment methods fortheir effectiveness on aromatic compositions.Blueberry wines were treated with three kinds of treatment methodsincluding combined treatment of glucose oxidase and catalase，single treatment of glucose oxidase， combinedtreatment of glucose oxidase and sodium pyrosulfite，and treatment of sterile distilled water as a control. Allgroups were preserved at 4 ℃ .Using the method of SPME coupled with GC -MS， changes in aromaticcompositions were determined after six months' storage. We report here that three kinds of blueberry winestreated with different methods were superior to the control group at the keeping of the contents of total aromaticcompositions， esters， typical aromatic compositions having positive contribution to the aroma of fruit wine andthat combined treatment of glucose oxidase and catalase is the best choice and more favorable for the storage ofblueberry wine.

glucose oxidase；blueberry wine；aromatic composition；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.030

2014-11-17

北京市高等学校教学名师资助项目（PXM2014-014306-000075）；公益性行业（农业）科研专项（201103037）；科技创新平台项目-酶制剂研发基地建设（PXM2014_014306_000064）

兰蓉（1974—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：酶制剂的应用研究。

*通信作者：辛秀兰（1968—），女（汉），教授，博士，研究方向：天然产物的分离鉴定研究。