伏慧慧，谭梅，郭艳秋，侯太芳，张丽，2，宋丽军，2，*

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

响应面法优化“酶法-超声波”连续提取核桃青皮多酚

伏慧慧1，谭梅1，郭艳秋1，侯太芳1，张丽1，2，宋丽军1，2，*

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

为了优化核桃青皮中多酚类物质的“酶法-超声波”连续提取工艺，在单因素试验基础上，通过Design Expert 8.05软件进行响应面设计与优化，得到了预测数学模型。结果表明，酶法提取最佳工艺条件为：采用纤维素酶，酶解温度55.00℃、酶解pH 5.00、酶解时间75.00min、酶添加量15.00 U/mL、液料比30∶1mL/g。酶解后继续采用超声波辅助二次提取，以50%“乙醇-水”为提取液，超声时间45min、超声温度50℃、超声功率100W，此条件下多酚提取率为61.36%。

响应面；纤维素酶；超声波；核桃青皮；多酚

核桃青皮，又称青龙衣，是核桃加工过程的的主要副产物。核桃青皮中含有丰富的多酚类化合物，如绿原酸、香草酸、槲皮素、没食子酸、核桃酮等[1-3]，具有较强的抗氧化活性，有抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂、抗癌、抗辐射等生理活性[4-5]。据统计，截止2010年底，新疆核桃青皮产量已达到13.41万t[6]，但长期以来，核桃青皮均作为废渣抛弃，造成了极大的环境污染和资源浪费，因此，有效利用新疆核桃青皮资源显得极为重要。

近年来，酶法、超声波、微波、超临界CO2等提取技术已在中药材及食品的生物活性成分提取领域得到了广泛应用，如多糖[6]、功能油脂[7]、石榴皮多酚[10]、皂甙[11]、茶多酚[13-16]、葡萄多酚[17-18]、余甘子多酚[19]、板栗多酚[20]、苹果多酚[21]等物质提取方面得到了深入研究，然而“酶法-超声波”连续提取在核桃青皮多酚提取中的研究却鲜见报道。

本文以新疆薄皮核桃温185青皮为原料，采用酶法提取其中多酚类物质，并利用超声波辅助“乙醇-水”溶液进行二次提取。以响应面设计优化“酶法-超声波”连续提取核桃青皮多酚的最佳工艺，为新疆核桃青皮多酚提取提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

核桃青皮：由于不同品种、生长期的核桃中多酚含量差异较大，本试验原料一次性采集。新疆薄皮核桃温185核桃青皮，树龄21年～23年，2012年10月2日购于新疆阿拉尔市。

福林-酚试剂：Sigma公司；没食子酸标准品：Sigma公司；

果胶酶，纤维素酶：南宁市基亚实验用品公司；中性蛋白酶：上海蓝季科技有限公司；乙醇、无水碳酸钠等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9101-1S减压干燥箱：上海鸿都电子科技有限公司；HH-S6恒温水浴锅：上海博讯事业有限公司医疗设备厂；FZ102粉碎机：北京市永光明医疗仪器厂；Neofuge 15R型台式高速冷冻离心机：北京阳光思特生物技术有限公司；SB-3200DTDN超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份公司；SHA-C恒温振荡器：常州国华生化仪器股份公司；岛津UV-Mini1240型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；MA110型电子天平：上海台衡仪器仪表有限公司。

1.3 提取工艺及要点

核桃青皮→预处理→减压干燥→粉碎、过筛→样品-酶-缓冲液混合→恒温震荡提取→加入乙醇→超声辅助二次提取→离心→上清液→测定总多酚。

操作要点：

1）核桃青皮切分后于50℃减压干燥，粉碎，过80目筛，置于棕色瓶中密封，-18℃冷冻保藏备用。

2）酶法提取：取5 g粉末与提取溶液（酶-磷酸盐缓冲液体系）混合，在恒温振荡器中避光提取。为避免有机溶剂引起酶变性，本试验在第一提取阶段采用水提取，然后在提取后的溶液中加入乙醇（使最终比例为乙醇∶缓冲液=1∶1）进行超声波辅助二次提取，离心后取上清液测定总多酚含量。

3）二次提取工艺：本试验确定采用“乙醇∶水=1∶1”的溶液为溶剂，采用超声波辅助二次提取超声功率100W，时间45min，温度50℃（避光）。离心后取上清液测定多酚含量。

1.4 试验方法

1.4.1 定性试验[2，4]

根据参考文献[2，4]对提取液进行多酚类定性分析。

1.4.2 总多酚测定

采用福林-酚法测定，参见参考文献[11-13]。

没食子酸标准溶液标准曲线为：y=0.102 5 x－0.009 1（R2=0.998 3）。

总多酚测定：取离心后的上清液1.0mL，按上述没食子酸标准曲线制作方法测定吸光度，计算样品中的多酚提取率。样品中的多酚以没食子酸的含量表示，单位为mg/g。

多酚提取率（%）=[提取液中多酚含量（g）/原料中多酚含量（g）]×100%。

1.4.3 酶法提取核桃青皮多酚工艺

1.4.3.1 酶的选择

分别选择纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等，在其最佳酶解温度、酶解pH条件下，分别酶解3.0 h，测定多酚提取率。

1.4.3.2 温度对多酚提取率的影响

在酶解pH 5.0、时间60 min、酶添加量12 U/m L、液料比30mL/g条件下，分别设置酶解温度30、40、50、60、70℃，考察温度对多酚提取率的影响。

1.4.3.3 酶解pH对多酚提取率的影响

在酶解时间60min、酶添加量12 U/mL、液料比30mL/g、温度50℃条件下，分别设置酶解pH为3.5、4、4.5、5、5.5、6，考察酶解pH对多酚提取率的影响。

1.4.3.4 酶解时间对多酚提取率的影响

在酶解pH 5.0、温度50℃、酶添加量12U/mL、液料比30m L/g条件下，分别设置酶解时间为30、50、70、90、110、130min，考察酶解时间对多酚提取率的影响。

1.4.3.5 酶添加量对多酚提取率的影响

在酶解温度50℃、pH 5.0、时间60min、液料比30mL/g条件下，分别设置酶解酶添加量3、6、9、12、15、18U/mL，考察酶添加量对多酚提取率的影响。

1.4.3.6 液料比对多酚提取率的影响

在酶解温度50℃、pH 5.0、时间60min、酶添加量12U/m L条件下，分别设置液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1mL/g，考察液料比对多酚提取率的影响。

在上述单因素试验的基础上，采用响应面设计优化“酶法-超声波”联合提取核桃青皮多酚工艺。

2 结果与分析

2.1 多酚类定性试验

多酚类定性试验见表1。

由表1可知，定性试验均显示阳性结果，说明核桃青皮提取物中含有多酚类物质。

2.2 酶法辅助提取核桃青皮单因素分析

2.2.1 酶的选择

不同种类的酶处理对多酚提取率的影响见图1。

由图1可知，试验过程所用的4种酶对多酚提取均有促进作用。其中纤维素酶的得率最高，达到43.20%（对照样为26.59%）。因选择纤维素酶作为后续试验用酶制剂。

2.2.2 酶解温度对多酚提取率的影响

酶解温度对核桃青皮多酚提取率的影响见图2。

由图2可知，酶解温度对核桃青皮多酚具有显著影响。在一定范围内，多酚提取率随着温度的升高而增加，当温度达到50℃～60℃时，多酚提取率达到最大；当温度高于60℃时，多酚提取率随温度的升高而逐渐减少，可能原因是高温导致酶的活性降低，且过高的温度也会对已溶出的多酚类物质起到破坏的作用[11]。故选择酶解温度为50℃，此时多酚提取率为54.76%。

2.2.3 酶解pH对多酚提取率的影响

酶解pH对核桃青皮多酚提取率的影响见图3。

由图3可知，pH 5.0时，多酚提取率达到最大值；pH偏离该范围时，多酚提取率显著减小。原因为酶的活性受环境pH的影响很大，在酶的最适pH条件下，酶反应速率达到最大，高于或低于该最适pH，反应速度都会下降[5]。故将最佳提取pH确定为5.0，此时多酚提取率为54.74%。

2.2.4 酶解时间对多酚提取率的影响

酶解时间对核桃青皮多酚提取率的影响见图4。

由图4可知，随着酶解时间的延长多酚提取率明显增高，当酶解时间为70min时，多酚提取率达到最高值57.56%；继续延长酶解时间，多酚提取率增加不显著。因此，选择最佳的酶解时间为70min。

2.2.5 酶添加量对多酚提取率的影响

酶添加量对核桃青皮多酚提取率的影响见图5。由图5可知，多酚提取率随酶添加量的增大而增大，这是由于纤维素酶催化核桃青皮细胞壁纤维素物质的水解，导致细胞壁结构损坏，细胞膜透性增加[8]，利用多酚类物质的溶出。在酶添加量为12U/mL时，多酚提取率为58.68%；继续增加酶量，多酚提取率虽略有增加，但幅度不大。综合提取效果及成本因素，选纤维素酶的酶添加量为12U/mL。

2.2.6 液料比对多酚提取率的影响

液料比对核桃青皮多酚提取率的影响见图6。

由图6可知，当液料比小于30∶1时，随着液料比的增大，多酚的得率迅速由35.41%增大至56.16%。当液料比大于30∶1时，多酚提取率虽略有增加，但增幅不大。考虑到后续的超声波辅助二次提取工艺，以及降低浓缩成本，增大溶剂的量对多酚提取的意义不大，因此选择液料比30∶1mL/g。

2.3 响应面分析

在单因素试验基础上，选取温度、pH、时间、酶添加量4个因素，运用Design Expert8.05软件的Box-Behnken原理进行试验设计。各因素及水平见表2。

响应面试验设计及结果如表3所示。

以多酚提取率为响应值（Y），利用Design Expert 8.05软件对表3数据进行二次多元回归拟合，得到响应值对自变量的多元回归方程：Y=58.75＋2.53A＋0.22B＋3.40C＋3.22D＋1.24AB-0.12 A C＋0.23AD-1.74BC＋0.15BD-2.30CD-2.63A2-3.47B2-1.80C2-0.32D2（1），其中，Y为核核桃多酚提取率的预测值，A、B、C、D分别为上述4个自变量的编码值。

由表4可以看出：Fmodel=499.2，P＜0.000 1，表明模型（1）极显著，R2=0.998 0，Adj R2=0.996 0，Pred R2=0.989 6，Adeq Precision=73.632，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型可以用来分析和预测“酶法-超声波”联合提取核桃青皮多酚的效果。

模型（1）中一次项A、C和D极其显著，B显著，交互项AB，BC和CD极其显著，A2、B2、C2极其显著。对表2的数据进行回归分析，剔除不显著交互项，得到核桃青皮多酚提取率（%）对各自变量的标准回归方程为：Y=10.5＋0.43A＋0.037 B＋0.58C＋0.55D＋0.21AB-0.30BC-0.39CD-0.45A2-0.59B2-0.31C2-0.055D2（2），各自变量对响应值的影响大小顺序为：C＞D＞A＞B。

图7为不同因素间交互作用对核桃青皮多酚提取效果的影响。通过等高线可直观地反映出不同变量间交互作用的显著程度，等高线越扁平说明因素之间交互作用越显著，对Y值（多酚提取率）的影响越大。由图7可知：温度和pH、pH和酶解时间、酶解时间和酶添加量交互作用的等高线均呈现椭圆、扁平状，表示上述因素之间的相互作用显著。

2.4 验证试验

根据软件和模型进行参数优化分析，得到核桃青皮多酚“酶法-超声波”联合提取的最佳工艺条件为：温度55.40℃，pH 5.04、时间74.93min、酶添加量15.00U/mL、液料比30∶1mL/g，在此条件下预测得率为62.54%。结合实际操作情况，将上述最优工艺调整为：温度55.00℃，pH 5.00、时间75.00min、酶添加量15.00U/mL、液料比30∶1mL/g，并在此优化工艺条件下进行验证试验。3次验证试验多酚提取率为61.36%，验证值与预测值相对误差相差较小，说明了模型的有效性。

3 结论

本试验在单因素基础上，通过响应面法优化了“酶法-超声波”联合提取核桃青皮多酚的最佳工艺，建立了可用的二次多项预测模型。各因素对多酚的影响顺序为：酶解时间＞酶添加量＞酶解温度＞酶解pH。最佳工艺参数为：粉碎粒度80目、酶解温度55.00℃、酶解pH 5.00、酶解时间75.00min、酶添加量15.00U/m L、液料比30：1mL/g，酶解后继续采用超声波辅助二次提取法，以50%“乙醇-水”为提取液，超声时间45min、超声温度50℃、超声功率100W，此条件下多酚提取率为61.36%。

参考文献：

[1]万政敏.核桃青皮中多酚类物质及其抗氧化性的分析[D].内蒙古农业大学,2007

[2]Toshiyuki F, Hideyuki I, Takashi Y. Antioxidative polyphenols fromwalnuts (Juglans regia L.)[J]. Phytochemistry, 2003(63):795-801

[3]Oliveira, I, Sousa, A, Ferreira, I C F R, et al. Total phenols, antioxidantpotential and antimicrobial activity of walnut (Juglans regia L.)green husks[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(7): 2326-2331

[4]石碧,狄莹.植物多酚[M].北京:科学出版社,2000:50-63

[5] Fernández-AgullóA,Pereira E,Freire M S,et al.Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut (Juglans regia L.)green husk extracts[J].Industrial Crops and Products,2013,42:126-132

[6]徐佳.核桃外果皮多酚提取纯化及抗氧化活性研究[D].新疆农业大学,2012

[7]王琛,石太渊.双酶酶解法提取姜油树脂工艺优化[J].食品科学, 2011,32(12):60-63.

[8]王岩岩,郭卢云,刘涛,等.纤维素酶提取绿茶茶多酚的研究[J].食品工业科技,2011(7):326-328

[9]崔春兰,郑虎哲,顾立众.响应曲面分析法优化苹果渣中多酚类物质的果胶酶辅助提取工艺[J].现代食品科技,2013,29(9): 2235-2240

[10]李志洲,刘军海.石榴皮中多酚类物质的提取及其抗氧化性研究[J].食品与发酵工业,2009(11):152-155

[11]董旭,杜先锋.响应面法优化纤维素酶提取山核桃蒲多酚类物质[J].食品科学,2013,34(4):109-113

[12]赵国建,王向东,王焕.提取方法对核桃青皮多酚提取效果的影响[J].农业工程学报,2012,28(1):351-355

[13]徐佳,辛立方,张瑞廷,等.改良的Folin-Ciocalteu比色法测定核桃外果皮中总多黔含量[J].食品工业科技,2012,33(6):60-63

[13]ZHANGG,ZHANG L,WUH,etal.Extraction of Tea-polyphenols from Tea Leaves by Ultrahigh Pressure Technique[J].Journal of Tea Science,2006,4:010

[14]Xi J,Shen D,Zhao S,et al.Characterization of polyphenols from green tea leavesusing a high hydrostatic pressure extraction[J].International journal of pharmaceutics,2009,382(1):139-143

[15]Todisco S, Tallarico P, Gupta B B. Mass transfer and polyphenols retentionin the clarification of black tea with ceramic membranes[J].Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2002 (3): 255-262

[16]ChandiniSK,Jaganmohan Rao L,Subramanian R.Influence of extraction conditions on polyphenols content and cream constituents in black tea extracts[J].International Journal of Food Science& Technology,2011,46(4):879-886

[17]GuerreroM S,Torres JS,NuñezM J.Extraction of polyphenols from white distilled grape pomace:optimization and modelling[J].Bioresource technology,2008,99(5):1311-1318

[18]Bucic-Kojic A,Planinic M,Tomas S,et al.Study of solid-liquid extraction kinetics of total polyphenols from grape seeds[J].Journal of Food Engineering,2007,81(1):236-242

[19]Yang L,Jiang JG,LiW F,et al.Optimum extraction process of polyphenols from the bark of Phyllanthus emblica L.based on the response surface methodology[J].Journal of separation science,2009, 32(9):1437-1444

[20]VázquezG,FreireM S,Santos J,etal.Optimisation of polyphenols extraction from chestnut shell by response surface methodology[J]. Waste and biomass valorization,2010,1(2):219-225

[21]Alonso-Salces R M,Korta E,Barranco A,et al.Pressurized liquid extraction for the determination of polyphenols in apple[J].Journal of chromatography A,2001,933(1):37-43

[22]Yilmaz Y,Toledo R T.Oxygen radical absorbance capacities of grape/wine industry byproducts and effect of solvent type on extraction of grape seed polyphenols[J].Journal of Food Composition and Analysis,2006,19(1):41-48

Optimization of Enzymatic-ultrasonic Continuous Extraction of Polyphenols from Walnut GreenPeels by Response Surface Methodology

FUHui-hui1，TANMei1，GUOYan-qiu1，HOUTai-fang1，ZHANGLi1，2，SONG Li-jun1，2，*
（1.College of Life Sciences，Tarim University，Alar843300，Xinjiang，China；2.Xinjiang Production and Construction CorpsKey Laboratory to Process of Agricultural Products in Southern Xinjiang，Tarim University，Alar843300，Xinjiang，China）

In order to optimize the enzymatic-ultrasonic continuous extraction processes of polyphenols fromwalnut green peels，the optimum extraction technology and mathematical regression model were established byresponse surface methodology on the basis of single-factor test. The results showed that the optimal extractionconditions were extraction temperature of 55 ℃， extraction time of 75.00 min， extraction pH of 5.00， enzymedosage of 15.00 U/mL， ratio of liquid to solid of 30 ∶ 1 mL/g. And the ultrasonic-assisted extraction was operatedafter enzymatic extraction for 45 min at the power of 100 W by 50 % ethanol solution as extractant. Under theseconditions， the maximum extraction yield of polyphenols from walnut green peels was 61.36 %.

response surface methodology； cellulase； ultrasonic； walnut green peels； polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.011

2014-11-17

新疆兵团工业科技计划项目（NO：2012BA011）；国家级大学生创新项目（NO：TDGCX201246，NO：201310757009）

伏慧慧（1992—），女（汉），本科，主要研究方向：粮油加工。

*通信作者