张翼 廖浩 赵秀云

摘要：为从中国江河、海水等水体中筛选油脂含量较高的微藻，采集了青岛海水、武汉南湖水的水样，分离了12株微藻。对微藻的油脂含量进行了测定，其中油脂含量最高的微藻为H2-1，油脂含量达到56.25%细胞干重，其次是BQ6，油脂含量为31.43%。BQ1、BQ2、BQ4、BQ6油脂含量也较高，达29%左右。PCR扩增获得微藻18S rDNA的部分片段，序列测定后，进行BLAST同源性分析。结果表明，QS1、QS2、QS3、BQ1、BQ2、BQ3、BQ4、BQ5、BQ6、H1-1、H2-2均属于小球藻属（Chlorella spp.），H2-1属于胶网藻属（Dictyosphaerium sp.）。该研究将为中国生物能源的生产和开发提供优良的藻种资源。

关键词：微藻；油脂；鉴定；小球藻；生物能源

中图分类号：S968.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0574-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.016

Isolation， Screening and Identification of Oil-rich Microalgae

ZHANG Yi，LIAO Hao，ZHAO Xiu-yun

（College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： In order to isolate oil-rich microalgae from river and sea， the water samples were collected from Qingdao sea and South lake in Wuhan city. 12 strains of microalgae were isolated. The results showed that the oil content of microalgae H2-1 was the highest with 36.25 percentage of cell dry weight. The oil content of microalgae BQ6 was 31.43 percentage. The oil contents of microalgae BQ1、BQ2、BQ4、BQ6 was as high as 29 percentage. Partial fragment of microalgae 18S rDNA was obtained by PCR amplification and sequenced. The results of BLAST analysis showed that microalgae QS1， QS2， QS3， BQ1， BQ2， BQ3， BQ4， BQ5， BQ6， H1-1 and H2-2 was belonged to Chlorella spp. H2-1 was belonged to Dictyosphaerium sp. It will provide good algae for the development of bio-energy in China.

Key words： microalgae； oil； identification； Chlorella； Bio-energy

生物能源是由活的生物体或其代谢产物产生的。第一代生物能源来自于玉米、大豆、甘蔗。第二代生物能源来源于纤维素类物质，木材废料如锯末，农业废料如玉米秆、小麦秸秆、快速生长的草和木材等。第三代生物能源来自于藻类（Algae）、蓝藻。藻类种类很多，包括单细胞的微藻、多细胞的大型藻类，存在于多种水体中，包括淡水、海水。微藻（包括绿藻、硅藻、蓝藻等）含有高水平的脂类，是发展生物能源的极佳生物来源。某些藻类含40%脂肪酸，这些脂肪酸能被提取并转化为生物燃料。目前已发现多种能作为生物能源的藻类，包括Neochloris oleoabundans、Scenedesmus dimorphus、Euglena gracilis、Phaeodactylum tricornutum、Pleurochrysis carterae、

Tetraselmis chui、Isochrysis galbana、Botryococcus braunii、Dunaliella tertiolecta、Chlamydomonas reinhardtii[1，2]。与陆地植物相比，藻类每单位面积可产生8～24倍生物柴油，使藻类位于生物柴油的首要地位。每公顷藻类可生产20 000～100 000 L油脂。而玉米每公顷仅产172 L油脂，大豆每公顷产446 L油脂，花生每公顷可产1 059 L油脂。可见，藻类与目前种植的植物相比，其单位面积可产20倍及更多的油脂。且藻类生长迅速，某些藻类在一天中能繁殖1～3代。微藻具有的这些优点，使其受到科研工作者的青睐。美国通过基因工程获得的小环藻，在实验室条件下，其脂质含量增加到占干重的60%以上，户外生产可达到40%以上[3-5]。

中国有着丰富的藻类资源，微藻无疑是制备生物柴油原料的优良替代品，具有广阔的开发前景。微藻热解所得的燃油热值高达33 MJ/kg。异养培养小球藻，并优化其培养条件后，可获得57.9%的燃油，是自养培养小球藻所产生燃油的3.4倍[6]。

然而，从藻类生产油脂仍处在实验室阶段，或者田间试验阶段，主要是因为藻类油脂的实际产量要比理论值低90%～95%，使得藻类生物油的生产成本非常高昂。本研究对中国水域中微藻进行筛选，寻找富油藻类，通过研究其生长特性、脂肪酸成分，寻找适合作为生物柴油原料的藻类。

1 材料与方法

1.1 藻种

微藻由本实验室从青岛海水、武汉南湖水中筛选获得，共计有12株。

1.2 培养基

从海水中筛选微藻采用L1海水培养基培养[7]，从南湖水筛选的微藻采用BG11和TAP培养基培养[8]。

1.3 微藻的培养

从采集的水样中分离微藻，采用藻类培养用的人工培养基进行培养，在光照度3 000 l x，光暗比为12 h∶12 h，（25±1） ℃温度条件下培养。每天摇动 2～3次，15 d后离心，收集藻泥，真空冷冻干燥，藻粉于 -20 ℃保存备用。采用超声波破碎处理细胞以提取油脂。

1.4 油脂含量的测定

油脂的提取参照Bligh等[9]的方法：在离心管中加入一定重量的（W）干藻粉、氯仿-甲醇（2∶1）混匀，于25 ℃放置24 h。涡旋 2 min，于3 000 r/min离心 10 min。在上清液中加入氯仿-甲醇混合液（2∶1），涡旋，于3 000 r/min离心 10 min。收集上清液，在70 ℃烘箱中烘干至恒重（W1）。

油脂含量=W1/W×100%

1.5 微藻的分类鉴定

对分离的富油微藻进行形态鉴定和分子鉴定。显微镜观察微藻的细胞形态。用CTAB 法提取微藻细胞的DNA[10]。取200 mg培养至对数期的微藻样品置于1.5 mL的离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液（2% CTAB，100 mmol/L Tris·HCl，pH 8.0，1.4 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，2%巯基乙醇），混匀，于65 ℃水浴保温1 h。取出后加等体积PCI提取液（苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25∶24∶1），混匀，4 ℃、10 000 r/min离心10 min。取上清液转至新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇，室温下放置10 min，沉淀DNA。4 ℃、10 000 r/min离心20 min，弃上清液，用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次。晾干，将DNA溶解于20 μL TE缓冲液（10 mmol/L Tris·HCl， 1 mmol/L EDTA）中。

以提取的微藻基因组DNA为模板，参照Timmins等[11]的方法设计引物扩增微藻18S rDNA序 列。采用的引物序列为：F 5′-GAAGTCGTAACAAGGTTTCC-3′；R 5′-TCCTGGTTAGTTTCTTTTC

C-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应程序为：95 ℃变性 5 min；95 ℃变性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 反应体积为 50 μL，其中包括DNA 模板 100 ng、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL（2U）、引物（10 μmol/L） 各 2 μL、 dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL、10 ×PCR Buffer 5.0 μL、 MgCl2（25 mmol/L） 3.0 μL 和 ddH2O 31.6 μL 。PCR 扩增产物以 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的 DNA 片段，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测定序列后，在 NCBI网站上（http：//www.ncbi.nih.gov）用 Blast进行同源分析。并构建系统发育树，确定其分类地位。

1.6 绘制生长曲线

培养微藻，每隔12 h取微藻培养液。以空白培养液为参照，测定藻液在750 nm的吸光度。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制微藻的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 微藻的分离

分别从青岛海水、南湖水采集水样，共分离到12株微藻。所得到的藻株生长速度较快，一般生长3 d即达到稳定期。对微藻BQ5和BQ6的生长曲线进行了测定。由图1可知，BQ6生长迅速，培养72 h吸光度达到最高，之后下降。BQ6培养48 h后进入稳定期。

2.2 微藻的油脂含量

对微藻的油脂含量进行了测定，结果如表1。在光照培养箱28 ℃下培养至稳定期收集藻体，测定油脂含量。其中油脂含量最高的微藻为H2-1，油脂含量达到56.25%细胞干重。其次是BQ5，油脂含量为31.43%。此外，BQ1、BQ2、BQ4、BQ6油脂含量较高，在29%左右。由于H2-1的生物量较少，生长时间比较长，在相同的培养条件下只得到0.16 g干重的藻体，综合微藻BQ5，BQ6的生长曲线所以选择BQ6作为遗传改造的目标藻株。小球藻与已有文献所报道的小球藻的油脂含量在 15%～55% 范围内的研究结果较一致。

2.3 微藻的分子鉴定

由图2可知，提取微藻总DNA，利用特异性引物，PCR扩增获得微藻18S rDNA片段，大小约750 bp。对PCR产物进行序列测定，在NCBI中进行BLAST同源性分析，并构建系统发育树。

由图3可知，BQ1与Chlorella sorokiniana 18S rRNA 基因同源性为90%。BQ2与C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性为90%。BQ3与C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性为90%。BQ5与C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性为90%。BQ6与C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性为90%。H2-2与Chlorella sp. CCAP 260/11 18S ribosomal RNA基因同源性为96%。QS1与C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性为90%。QS2与C. sorokiniana 18S rRNA基因同源性为90%。H2-1与Dictyosphaerium ehrenbergianum strain 18S rRNA基因同源性为87%。

综合序列比对、系统进化树、显微形态等结果，初步确定QS1、QS2、QS3、BQ1、BQ2、BQ3、BQ4、BQ5、BQ6、H1-1、H2-2均属于小球藻属，H2-1属于胶网藻属。

3 讨论

分离鉴定结果表明，在武汉南湖水、青岛海水中小球藻分布较多，小球藻为这两个水域的优势藻种。分离的11株小球藻与文献所报道的小球藻的油脂含量一般在15%～55%范围内的研究结果较一致。其中，小球藻Chlorella sp. BQ6油脂含量高、生长迅速，可作为进一步发展生物能源的优良藻种。研究表明，小球藻可在光照下自养生长，也可在无光照条件下异养培养，通过优化其异养生长的条件，可获得高油脂含量[12，13]。小球藻是一种球形或椭球形单细胞绿藻，细胞大小约2～12 μm，广泛分布于各种生境，特别是淡水环境中，适应性强、可进行大规模培养，细胞中含有的短链脂肪酸与柴油中脂肪酸相近，是一种优质的生物柴油原料。徐进等[14]分离到多株油脂含量高的小球藻，Chlorella sp. NMX37N的藻细胞中总脂含量可达到33%左右。韦志勇等[15]从7株小球藻中筛选到1株油脂产率较高的普通小球藻C.vulgaris No. 1，油脂含量和油脂产率分别为23.71%和0.206 g/L。

利用微藻制备绿色能源具有广阔的前景。为了获得商业化生产，许多与脂类合成途径及油脂调控相关的基础生物学问题需要解决。如有效控制藻类的生长、脂类代谢，实现工业上大规模培养及下游加工技术的突破。可从以下几个方面进行改进：①通过基因工程和优化微藻的培养条件而进一步提高微藻的油脂含量和生物量；②提高工业上采用的微藻生物反应器的效率；③提取微藻细胞中的蛋白、碳水化合物等其他营养成分，开发更多的产品。本研究筛选出了高油脂含量的小球藻，后期研究中可进一步利用基因工程技术对富油微藻进行遗传改良，进一步提高微藻的油脂含量，为中国生物能源的生产和开发提供优良的藻种资源。

参考文献：

[1] GUSCHINA I A， HARWOOD J L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae[J]. Progress in Lipid Research， 2005， 45：160-186.

[2] LI Y， HORSMAN M， WU N L， et al. Biofuels from microalgae[J]. Biotechnol Prog， 2008， 24：815-820.

[3] CHISTI Y. Biodiesel from microalgae[J]. Biotechnol Adv， 2007，25：294-306.

[4] RODOLFI L， ZITTELLI G C， BASSI N， et al. Microalgae for oil： Strain selection， induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor[J]. Biotechnol Bioeng， 2009， 102：100-112.

[5] HU Q， SOMMERFELD M， ERIC J， et al.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production： Perspectives and advances[J]. Plant J， 2008， 54：621-639.

[6] 缪晓玲，吴庆余.微藻生物质可再生能源的开发利用[J].可再生能源，2003，109：13-16.

[7] GUILLARD R R L， HARGRAVES P E. Stichochrysis immobilis is a diatom， not a chrysophyte[J]. Phycologia， 1993， 32： 234-236.

[8] 马 帅.海南微藻种质资源收集、鉴定及高含油量微藻的筛选[D].海口：海南大学，2010.

[9] BLIGH E G， DYER W J.A rapid method of total lipid extraction and purification[J]. Can J Biochem Physiol，1959，37： 911-917.

[10] 张桂和，徐碧玉，王 珺.几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测[J].热带海洋学报，2007（26）：68-72.

[11] TIMMINS M， THOMAS S R， et al. Phylogenetic and molecular analysis of hydrogen-producing green algae[J]. J Exp Bot， 2009， 60： 1691-1702.

[12] 杨 凯，王 涌，史全良，等.不同质量浓度NaNO3 对3 种微藻生长及总脂肪酸含量和组成的影响[J].植物资源与环境学报， 2010， 19（1）：43.

[13] 闫 海，张 宾，王素琴，等.小球藻异养培养的研究进展[J].现代化工，2007，27（4）：18.

[14] 徐 进，徐旭东，方仙桃，等.高产油小球藻的筛选及其油脂分析[J].水生生物学报，2012（36）：426-432.

[15] 韦志勇，黄宝祥，冯 伟，等.产油脂小球藻的筛选及其培养基的研究[J].中国油脂，2011（36）：37-40.