李新源　郭亚民　吴新民　王皓

作者单位: 810000西宁市，青海大学研究生院(李新源) ;青海省人民医院普外科(郭亚民、吴新民、王皓)

大鼠急性胰腺炎Caspase-3及Survivin在胰腺组织中表达的实验研究

李新源郭亚民吴新民王皓

作者单位: 810000西宁市，青海大学研究生院(李新源) ;青海省人民医院普外科(郭亚民、吴新民、王皓)

【摘要】目的检测Caspase-3及Survivin在急性胰腺炎大鼠胰腺组织中的表达并探讨其与胰腺组织损伤的关系。方法60只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、胰腺炎6 h组、胰腺炎12 h组及胰腺炎24 h组。采用胰腺被膜下注射牛磺胆酸钠(Na-Tc)建立急性胰腺炎模型。分别检测4组大鼠血清淀粉酶(AMY)、胰腺病理损伤、胰腺组织中Caspase-3及Survivin的表达程度。结果假手术组、胰腺炎6 h、12 h、24 h组组间两两比较血清淀粉酶及胰腺组织病理评分胰腺组织Caspase-3及Survivin平均光密度表达差异均有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3、Survivin、血清淀粉酶及胰腺病理评分均有相关性(P<0.05)。结论急性胰腺炎过程中伴随着Caspase-3及Survivin的表达紊乱，并且与胰腺损伤密切相关。

【关键词】胰腺炎，急性; Caspase-3; Survivin;大鼠

E-mail: gym135@ yeah.net

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种临床常见的、凶险的急腹症之一，其发展迅速、病情危重，常可出现全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)导致患者死亡［1］。其中Caspase-3及Survivin在AP时通过调控患者外周血中性粒细胞的凋亡延迟作用参与调节AP进程中胰腺腺泡细胞的凋亡，使损伤的胰腺细胞由凋亡转为坏死，进而加重AP病情进展。白细胞过度激活-多种炎性因子和介质级联瀑布反应、胰腺微循环障碍学说均认为在SAP疾病中存在，这更加重胰腺微循环障碍，并与SIRS、MODS密切相关而相关，对微循环障碍的治疗及抗凝血系统治疗也是有效的。本实验通过检测Caspase-3及Survivin在AP胰腺组织中的表达，从而探讨二者与胰腺组织损伤的关系。

1　材料与方法

1.1材料及分组选用健康雄性SPF级Wistar大鼠共60只［由甘肃省中医学院实验动物中心提供，动物许可证号: SCXK(甘) 2009-0004］，体重180～240 g，随机分成4组:假手术组、胰腺炎6 h组、胰腺炎12 h组胰腺炎24 h组，每组15只。

1.2动物模型的制备采用胰腺被膜下注射5%牛磺胆酸钠(Na-Tc)制备AP的方法。大鼠术前禁食12 h，不禁水。用25%乌拉坦按4 ml/kg做腹腔内注射麻醉。胰腺炎组按1 ml/kg胰腺被膜下注入5%牛磺胆酸钠，假手术组仅作剖腹术，轻翻动胰腺组织，术后禁食，不禁水。

1.3标本采集假手术组在6 h时处死，胰腺炎组在造模后6 h、12 h、24 h 3个时点分批解剖大鼠，观察胰腺大体病理变化。由腹主动脉采血3 ml，注入密封促凝采血管中静置1 h后以3 000 r/min低温离心10 min，分离血清(用于淀粉酶测定)。取部分胰腺组织浸泡在10%甲醛液后备用(用于胰腺组织病理评分及Caspase-3、Survivin免疫组化测定)。

1.4检测仪器及试剂血清淀粉酶检测采用日本Sysmex株式会社CHEMIX-800全自动生化分析仪。取出的胰腺组织做HE染色及免疫组化。免疫组化Caspase-3、Survivin一抗、二抗试剂均购买于北京博奥森生物技术有限公司，一抗稀释比1∶500，测定平均光密度的软件为Image-Pro Plus 6.0，每个胰腺组织切片随机选取4个图像进行光密度测定。

1.5统计学分析应用SPSS 18.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用one-way ANOVA，并用S-N-K进行两两比较，相关关系采用Pearson相关分析，进行双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胰腺组织病理评分(histopathologic scores，HS)及血清淀粉酶胰腺病理评分采用Grewal改良评分标准［2］随即采取四个视野，从水肿、坏死、炎症、出血4个方面进行评分:假手术组、胰腺炎6 h、12 h、24 h组组间两两比较胰腺组织病理评分差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组、胰腺炎6 h、12 h、24 h组组间两两比较血清淀粉酶差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、2，图1～4。

表1　AP胰腺病变严重程度评分标准(改良Grewal法)

表2　血清淀粉酶及HE染色胰腺病理评分比较n=15，±s

表2　血清淀粉酶及HE染色胰腺病理评分比较n=15，±s

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与胰腺炎6 h组比较，#P＜0.05;与胰腺炎12 h组比较，△P＜0.05

指标　假手术组　胰腺炎6 h组　胰腺炎12 h组　胰腺炎24 h组　F值　P值血清淀粉酶(U/L)　981±311　2 668±481*　3 667±459* #　6 593±312* #△537.19＜0.05 HE病理评分(分) 1.03±0.48 3.03±0.74*　5.90±0.80* #　9.76±0.77* #△423.59＜0.05

图1　假手术组胰腺组织(HE ×200)

图2　胰腺炎6 h组胰腺组织(HE ×200)

图3　胰腺炎12 h组胰腺组织(HE×200)

图4　胰腺炎24 h组胰腺组织(HE×200)

2.2大鼠胰腺中Caspase3及Survivin的表达假手术组、胰腺炎6 h、12 h、24 h组组间两两比较胰腺组Caspase3平均光密度差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组、胰腺炎6 h、12 h、24 h组组间两两比较胰腺组Survivin平均光密度差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图5～12。

2.3Caspase-3、Survivin、血清淀粉酶及HE染色胰腺病理评分相关关系Caspase-3与Survivin呈负相关(r=－0.686，P＜0.05)，Caspase-3与血清淀粉酶呈负相关(r=－0.800，P＜0.05)，Caspase-3与病理评分呈负相关(r=－0.802，P＜0.05)，Survivin与血清

表3　胰腺炎大鼠不同组别Caspase3、Survivin平均光密度比较　n=15，±s

表3　胰腺炎大鼠不同组别Caspase3、Survivin平均光密度比较　n=15，±s

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与胰腺炎6 h组比较，#P＜0.05;与胰腺炎12 h组比较，△P＜0.05

指标　假手术组　胰腺炎6 h组　胰腺炎12 h组　胰腺炎24 h组　F值　P值胰腺组织Caspase-3平均光密度　0.500±0.056　0.442±0.058*　0.370±0.059* #　0.283±0.052* #△165.08　＜0.05胰腺组织Survivin平均光密度　0.300±0.044　0.399±0.056*　0.481±0.056* #　0.544±0.057* #△230.24　＜0.05

图5　假手术组胰腺Caspase-3(免疫组化×200)

图6　胰腺炎6 h组胰腺Caspase-3(免疫组化×200)

图7　胰腺炎12 h组胰腺Caspase-3(免疫组化× 200)

图8　胰腺炎24 h组胰腺Caspase-3(免疫组化× 200)

图9　假手术组胰腺Survivin(免疫组化×200)

图10　胰腺炎6 h组胰腺Survivin(免疫组化×200)

图11　胰腺炎12 h组胰腺Survivin(免疫组化×200)

图12　胰腺炎24 h组胰腺Survivin(免疫组化×200)

淀粉酶呈正相关(r=0.811，P＜0.05)，Survivin与病理评分呈正相关(r=0.821，P＜0.05)，血清淀粉酶与病理评分呈正相关(r=0.950，P＜0.05)。见表4。

表4　Pearson相关分析

3　讨论

AP是一种并发症多而严重，临床治疗棘手，病死率高，恢复时间较长的疾病。其发病机制是一个多因素参与的复杂的病理生理过程，在目前国内外诸多学者探讨并提出与AP的发病机制相关学说有: (1)胰酶自身消化学说:是AP最基本的发病机制学说。正常情况下，胰腺分泌合成的胰酶以无活性的酶原形式存在，当发生胰管梗阻、十二指肠液或胆汁反流等时，导致胰蛋白酶在胰腺内被异位激活，活化的胰蛋白酶进而激活其他蛋白酶，引起胰腺自身消化，是重症AP患者发生多器官损害的重要病理生理基础。(2)炎性因子学说:该学说阐述AP的发病机制也被广泛接受。AP是一种局部或全身性的炎性反应，胰腺炎早期，IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子触发炎症，更多的炎性因子发生瀑布样级联反应，导致全SIRS、MODS。 (3)细胞凋亡学说:胰腺腺泡细胞对损伤的反应在AP的发病过程中起关键作用。轻症AP时，大量胰腺腺泡细胞发生凋亡;而重症AP时，胰腺腺泡细胞发生明显坏死，但只有少量细胞发生凋亡。因此，胰腺腺泡细胞凋亡与疾病严重程度呈显著负相关，胰腺腺泡细胞通过凋亡阻止疾病进一步进展为重症AP。近年来，凋亡抑制蛋白在胰腺炎中的作用成为研究热点。(4)肠道细菌易位学说:正常情况下，肠道细菌不易突破肠黏膜的屏障进入肠外组织。发生AP时，肠黏膜通透性增加，肠道细菌过度生长，导致肠道菌群进入腹腔，经胆管、胰胆管逆行感染，刺激活化的巨噬细胞产生大量炎性因子，进一步损害胰腺。(5)其他学说:包括氧化应激学说、腺泡内钙超载学说等等。研究发现，在AP时胰腺腺泡细胞对损伤的反应在整个发病过程中起着关键的作用，诱导和抑制胰腺腺泡细胞凋亡可影响AP的严重程度和改变疾病的转归［3］。在AP的发病过程中，细胞凋亡、细胞因子、炎性介质等因素均起着举足轻重的作用，例如Fas、TNF-α、IL-1、NF-κB和IL-18等均参与了AP的发病机制和病理生理过程，然而Caspase对上述物质在凋亡信号转导和炎性反应过程中具有重要的调控作用，Survivin则是一种凋亡抑制基因，具有调节细胞周期等多种生物活性的作用。

Caspases是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是具有特异地断开天冬氨酸残基后肽键的功能。Caspases主要行使两类功能:诱导凋亡和参与炎性反应。其中Caspase-2、3、6、7、8、9和10主要参与凋亡信号转导，其他一些Caspases则主要参与细胞因子的激活和炎性反应。其中Caspase-3在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥着重要功能。Caspase-3正常以酶原(32 kD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17 kD)和两个小亚基(12 kD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。本实验结果提示Caspase-3蛋白广泛表达于正常胰腺腺泡细胞、胰腺导管上皮细胞及部分胰腺间质浸润的炎性细胞，胞浆分布，呈棕黄色细颗粒状，并且随着AP病情的加重，Caspase-3表达逐渐减弱，胰腺细胞组织凋亡系统功能减弱，从而导致未凋亡的细胞逐渐增多，致炎因子逐渐增加［4］。大量的炎性因子诱导发生大量的级联瀑布反应，导致机体出现全身SIRS，最终病情逐渐加重，出现MODS。

Survivin是一种凋亡抑制基因，是迄今发现分子量最小、作用最强的凋亡抑制因子之一，位于染色体17q25上，其编码的Survivin蛋白是由142个氨基酸组成，分子量为16.5 kD的蛋白质，以同源二聚体的形式存在，表达于细胞周期的G2/M期。Survivin仅表达于胚胎组织、发育中的胎儿组织、胸腺和生殖腺，而在分化成熟的成人胰腺组织中不表达或低表达。Survivin的生物学功能主要是通过抑制凋亡通路下游的Caspase-3、Caspase-7从而对抗Fas、Bax、细胞色素和Caspase诱导的凋亡，对抗G2/M期细胞凋亡的诱导，Survivin可通过抑制炎性细胞的凋亡而在炎症中发挥作用。因此，Survivin的异常升高可以直接加机体炎症的级联反应，使AP病情恶化［5］。有研究表明Survivin是评估疾病预后的独立预测因子，Survivin过表达越高，提示疾病预后越差［5］。本实验结果显示在正常胰腺组织见Survivin蛋白弱表达，腺泡细胞凋亡率很低。建立AP模型后Survivin蛋白广泛表达于胰腺腺泡细胞、胰腺导管上皮细胞及部分胰腺间质浸润的炎性细胞，胞浆分布，呈棕黄色细颗粒状，在炎症浸润区及腺泡细胞坏死区表达稍高。在炎症程度较轻的AP6 h组Survivin呈弱表达，腺泡细胞凋亡率较高。随胰腺炎症程度的加重，Survivin蛋白的表达水平逐渐升高，而腺泡细胞凋亡率则逐渐下降。提示Survivin蛋白表达与胰腺坏死呈正相关，可能是预测AP严重程度的一个重要指标。这一结果可能说明Survivin蛋白在AP病程中不仅使激化的致炎症细胞存活，加重机体炎性反应，而且通过其抗凋亡作用使受炎症损伤的胰腺组织细胞由凋亡转为坏死，从而促使细胞内胰酶外溢释放，加重AP病情。

多种因素导致的机体凋亡与抗凋亡机制失调，引发AP病情加剧，其中包括Caspases家族及Survivin凋亡抑制蛋白家族的改变。凋亡紊乱的程度与AP继发ARDS和MODS密切相关。作为Caspases家族及凋亡抑制蛋白家族的代表，Caspase-3与Survivin在各自的家族中具有重要意义。测定Caspase-3与Survivin在评估AP的进展及严重度上被证明有用，动态检测上述指标，有助于预测AP的严重程度和转归。因此，对AP的治疗应在积极治疗胰腺炎本身及病因治疗的同时，改善局部凋亡紊乱、减少局部炎性因子的紊乱有助于减少AP疾病进一步恶化的程度及病死率。

AP是由多种因素共同参与的病理生理过程，各因素之间既相互独立又相互制约，共同影响疾病的发生转归。基于上述发病机制，衍生出众多新的治疗方案如应用细胞因子抗体及拮抗剂，构建各种载体基因治疗以及早期应用血管活性药物及微循环保护剂、抗氧化剂和氧自由基清除剂、扩容等手段，抑制或诱导细胞凋亡，改善机体微循环，去除机体游离氧自由基，从而改善AP患者预后及转归［6，7］。本实验说明: (1) AP病程中细胞凋亡紊乱的程度是随着病情的发展而逐渐加重的; (2) AP病情严重程度与Caspase-3、Survivin指标变化有着密切的关系。因此，测定Caspase-3与Sur vivin具有重要的临床意义，可以深入研究AP病变发生发展中的启动因子和恶化因子，以及它们之间的相互影响和制约关系，这对于AP的治疗有着深远的意义。

参考文献

1王皓，王昀，田青山，等.急性胰腺炎患者微循环障碍的动态变化.江苏医药，2012，38: 69-71.

2Grewal HP，Moheyel DA，Gaber L，et al.Amelioration of the physiologi and biochemical changes of acute pancreatitis wsing an anti-TNF-alph polyclonal antiboldy.Am J Surg，1994，167: 214-219.

3Xu P，Lou XL，Chen C，et al.Effects of peroxisome proliferator-activate receptor-γ activation on apoptosis in rats with acute pancreatitis.Dig Di Sci，2013，58: 3516-3523.

4汤永辉，苗毅，陆子鹏，等.高脂血症促使大鼠急性胰腺炎胰腺腺泡由凋亡趋向坏死.中华肝胆外科杂志，2010，16: 381-384.

5李震东，马清涌，罗羽宏.Survivin基因在急性胰腺炎中的表达及其意义.南方医科大学学报，2009，29: 1141-1146.

6Mahajan UM，Gupta C，Wagh PR，et al.Alteration in inflammatory/apop totic pathway and histone modifications by nordihydroguaiaretic acid pre vents acute pancreatitis in swiss albino mice.Apoptosis，2011，16: 1138 1149.

7Lin Z，Guo J，Xue P，et al.Chaiqinchengqi decoction regulates necrosis apoptosis via regulating the release of mitochondrial cytochrome c an caspase-3 in rats with acute necrotizing pancreatitis.J Tradit Chin Med 2014，34: 178-183.

Experimental study on the expression of Caspase-3 and Survivin in rats with acute pancreatitis

LI Xinyuan*，GUO Yamin，WU Xinmin，et al.*
Graduate School of Qinghai University，Qinghai，Xining 810000，China

【Abstract】Objective To detect the expression levels of Caspase-3 and Survivin in rats with acute pancreatitis，and to explore their correlation with pancreatic tissue damage.Methods Sixty SPF male Wistar rats were randomly divided into four groups: sham-operation group (n=15)，6 hours after pancreatitis group (6h group，n=15)，12 hours after pancreatitis group (12h group，n=15)，24 hours after pancreatitis group (24h group，n=15).The animal models with pancreatitis were induced by injection of 5% Na-Tc under capsula pancreatis.The activity of serum amylase，pathological injury of pancreas，expression levels of Caspase-3 and Survivin were detected for all the groups.Results There were significant differences in the activity of serum amylase，pathological injury of pancreas and the expression levels of Caspase-3 and Survivin among sham-operation group，6h group，12h group，24h group with each other (P<0.05).There were close correlations among Caspase-3，Survivin，serum amylase and pathological injury scoring.ConclusionThe process of acute pancreatitis is accompanied with the expression disorder of Caspase-3 and Survivin，furthermore，which is closely correlated to pancreas injury.

【Key words】acute pancreatic; Caspase-3; Survivin; rats

(收稿日期:2014－12－23

通讯作者:郭亚民，810007西宁市，青海省人民医院普外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.003

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1293－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 576.1