闫 彬

(重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆 400045)



藻类聚合磷酸盐的分析方法

闫 彬

(重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆 400045)

对藻细胞内部聚合磷酸盐的检测方法进行了总结，并从细胞染色法、化学提取分析法两方面进行了具体的论述，比较了不同分析方法的优缺点，有助于藻类聚合磷酸盐研究的发展。

聚合磷酸盐，藻类，染色法，化学分析法

聚合磷酸盐(polyphosphate,polyP)是由三个以上正磷酸根残基通过高能磷酸键连接而成的线性聚合体，其广泛存在于自然界，在火山冷凝物、深海热泉和生物(细菌、真菌、原生动物、植物、哺乳动物)都有发现，其在地球上的出现时间甚至比核酸、蛋白质更早，但由于检测方法的限制，聚合磷酸盐长期被忽视。聚合磷酸盐首先发现于迂回螺菌中，故又被称为迂回体，Graham在1833年通过熔合磷酸二氢钠后快速冷却的方法最早合成了无机聚磷酸钠盐[1,2]。polyP在生命系统的主要功能有:贮存磷和能量，螯合和贮存阳离子、构成膜通道、参与磷转运、参与细胞膜形成、调控酶活性、调控胁迫响应等[3-5]。

藻类广泛分布于淡水和海洋生态系统中，为全球贡献超过50%的初级生产力，在维持水生生态系统稳定、促进营养元素(碳、氮、磷)的生物地球化学循环中扮演举足轻重的角色。目前藻类水华与水体营养状态的研究集中于水体中总磷、溶解性总磷、氮磷比方面，对细胞内部的磷存储机制涉及较少[6-8]。由于聚合磷酸盐聚合度变化范围广、结构复杂且藻类体内含量少，缺乏准确可行的测定方法，藻类体内聚合磷酸盐的研究发展缓慢。本文对藻类细胞内聚合磷酸盐的分析方法进行总结，以期在分析方法的实际应用选择上提供借鉴。

1 聚合磷酸盐的染色方法

聚合磷酸盐在研究中，最常用、最早的研究方法是通过染色验证其存在性，常用的染色剂有甲苯胺蓝、亚甲基蓝(美兰)、中性红，异染粒在染色剂的作用下呈现不同颜色的亮光，但由于染色剂染色对象的非选择性，胞内的其他聚合物也会被染上颜色，会削弱甚至屏蔽聚合磷酸盐的染色效果；另外染色法只能定性地判断聚合磷酸盐的存在，不能对其含量进行测定。

亚甲基蓝在pH较低时(约2.8)方可与多聚物结合，与聚合磷酸盐结合后呈粉紫色，细胞呈蓝色，由于两种颜色的区别并不鲜明，该方法适用于胞内储存大量聚合磷酸盐的情况，染色15 s即可。奈瑟氏染色时需要先将亚甲基蓝溶解在酸性溶液中，与聚合磷酸盐结合后颗粒呈紫黑色，细胞为棕黄色，明显颜色反差使得奈瑟氏染色比亚甲基蓝染色效果更好，染色30 s的效果较好。对奈瑟氏方法的改进取得了良好效果，与传统方法相比，使用的复染液都是乙液，改进方法将传统使用的初染液成分(亚甲基蓝与结晶紫的混合液)改为仅亚甲基蓝，新方法染色后的颗粒呈墨绿色，使用的试剂相对简单，也便于与细胞区分[10,11]。

作为生物研究中常用的荧光染料，4’,6—二脒基—2-苯基吲哚(4’,6—diamidino—2-phenylindole，DAPI)也可以对胞内聚合磷酸盐进行染色，需使用荧光显微镜进行观察[12]。DAPI常用于DNA的染色，同时也可对脂类进行染色，DAPI与DNA结合后呈蓝白色荧光，与聚合磷酸盐结合后呈黄色，与脂类染色也呈黄色，不过DAPI—脂类的荧光在几秒就会猝灭，而DAPI—聚合磷酸盐的黄色荧光不易猝灭[13]。DAPI染色使用的激发光为紫外光(330 nm～385 nm)，发射光波长为526 nm，对于细菌的染色发现染料浓度为1 mg/L，染色1 h可以减轻高浓度染料(50 mg/L)所带来的背景荧光过高的问题[14]，Allan and Miller[12]建立了对藻类胞内聚合磷酸盐荧光观察的方法，并得到广泛应用。

2 聚合磷酸盐的化学分析方法

聚合磷酸盐的化学分析方法首先通过化学试剂将聚合磷酸盐从细胞内提取出来，然后将其分解为无机磷酸盐并使用钼锑抗法进行测定。由于聚合磷酸盐的聚合度变化范围大，目前没有对特定聚合度的聚合磷酸盐直接测定的方法。

早期聚合磷酸盐的提取方法是沿用核酸提取方法，直到1936年Mac Farlane提出了胞内聚合磷酸盐的提取方法，根据该方法，聚合磷酸盐分为可溶于酸(5%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)或0.5M 高氯酸(perchloric acid，PCA))的聚合磷酸盐和不可溶于酸的聚合磷酸盐。对于不可溶于酸的聚合磷酸盐，常用方法是用稀碱液(pH 8～9)进行提取；Schmidt and Thannhauser[15]使用1M KOH在37 ℃进行不同时间的提取，该方法得到了广泛应用；也有研究使用热酸对聚合磷酸盐进行提取，如使用5%TCA或10%高氯酸在80 ℃～100 ℃进行反应，此反应条件下可将大部分聚合磷酸盐分解为正磷酸盐。

是否溶于酸是聚合磷酸盐的一种分类标准，宽泛的分类不利于明确不同聚合磷酸盐的功能。Lagen和Liss依次使用1%TCA(0 ℃)、饱和NaClO4溶液、NaOH溶液(pH 10)和NaOH溶液(0.05M)对聚合磷酸盐进行了分步提取，实现对不同链长聚合磷酸盐的分离。该方法之所以被广泛应用，是因为不同链长的聚合磷酸盐在胞内的存在位置有所不同，进而表现出不同的生理学作用，比是否溶于酸的分类更细致，如低聚合度的聚合磷酸盐在细胞中常以游离态存在，而高聚合度的聚合磷酸盐则常与生物大分子(蛋白质、DNA)形成复合物。Miyachi等[17-18]通过对小球藻(Chlorella ellipsoiden)的分步提取实验将上述分类进一步细化，使用的试剂依次为8%TCA(0 ℃)，KOH(pH 9,0 ℃)，KOH(2M)，PCA，相应地将提取到的聚合磷酸盐分别称为：polyP-A，polyP-B，polyP-C，polyP-D，其中，polyP-A是可溶于酸的聚合磷酸盐；polyP-B虽不溶于酸，但溶于pH=9的低温碱液；polyP-C，既不溶于酸，也不溶于pH=9的低温碱液；polyP-D可溶于2M KOH，但可以被酸溶解。在光合作用中，polyP-A和polyP-C作为媒介将磷从无机正磷酸盐传递给DNA和磷蛋白；polyP-B和polyP-D则作为细胞的磷库，在环境中磷过量时将磷酸盐储存于体内，外界磷缺乏时分解为正磷酸盐以供细胞维持生命活动。

虽然使用强酸、强碱溶液可以对胞内聚合磷酸盐进行较完整的提取，但不可避免的是，如此剧烈的反应条件势必引起聚合磷酸盐的分解，一定程度上会高估正磷酸盐的含量，因此研究人员尝试了温和反应条件下聚合磷酸盐的提取，以获得尽可能完整的聚合磷酸盐，这些提取试剂有热水、碳酸钠溶液、氯化钠溶液和乙醇预处理后的冷水提取。相比较而言，最后一种提取方法的效果较好。不过，温和反应条件的提取都存在一个缺陷，即对胞内聚磷的提取可能是不完全的。Eixler等[19]分别使用冷水，热水，NaOH，NaCl，NaNO3作为提取试剂对小球藻(Chlorella vulgaris)体内的聚合磷酸盐进行提取，认为NaOH和热水处理适于对聚合磷酸盐的提取，提取过程中聚合物水解量较少，不过使用NaOH作为提取试剂时，测定正磷酸盐含量前需先对溶液pH进行调整。

3 展望

作为生物体内重要的储磷、储能物质，聚合磷酸盐在藻类对于营养吸收、存储、利用过程中的功能仍有待研究，需要继续开发更精细、更快捷的检测方法。

[1]Graham T. Researches on the arseniates, phosphates and modifications of phosphoric scid. Phil. Trans.R.Soc.London,1833,253(123):75-77.

[2]Franklin MH. Inorganic polyphosphates in biology: structure, metabolism, and function. Bacterilolgical Reviews,1966,30(4):772-794.

[3]Kumble KD, Kornberg A. Inorganic polyphosphate in mammalian-cells and tissues.Journal of Biological Chemistry,1995,270(11):5818-5822.

[4]Achbergerová L, Nahálk J. Polyphosphate-an ancient energy source and active metabolic regulator.Microbial Cell Factories,2011,63(10):579-591.

[5]Arthur K, Narayana RN, Dana A. Inorganic polyphosphate:A molecule of many functions.Annu. Rev Biochem,1999(68):89-125.

[6]Litchman E, Klausmeier CA, Schofield OM, et al. The role of functional traits and trade-offs in structuring phytoplankton communities:scaling from cellular to ecosystem level.Ecology Letters,2007,10(12):1170-1181.

[7]张胜花，常军军，孙珮石.水体藻类磷代谢及藻体磷矿化研究进展.生态环境学报，2013(7):1250-1254.

[8]沈国英,朱小明.几种浮游单细胞藻类磷代谢的初步研究.厦门大学学报(自然科学版),1996(4):619-624.

[9]Kulaev IS, Vagabov VM. Polyphosphate metabolism in micro-organisms. Advances in Microbial Physiology,1983(24):83-171.

[10]钱轶超，陈英旭，楼莉萍.核磁共振技术在沉积物磷素组分及迁移转化规律研究中的应用.应用生态学报,2010(7):1892-1898.

[11]任世英，肖 天.聚磷菌体内多聚物的染色方法.海洋科学,2005,29(1):59-63.

[12]Allan RA, Miller JJ. Influence of S-adenosylmethionine on DAPI-induced fluorescence of polyphosphate in the yeast vacuole-DAPI.Can.J.Microbiol,1980(26):912-920.

[13]Smolders GJF, Van der Meij J, van Loosdrecht MCM, et al. Model of the anaerobic metabolism of the biological phosphorus removal process: stoichiometry and pH influence.Biotechnol Bioeng,1994(43):461-470.

[14]Zilles JL, Hung CH, Noguera DR. Presence of Rhodocyclus in a full-scale wastewater treatment plant and their participation in enhanced biological phosphorus removal: International Water Association.Rome Italy,2001(2):75-81.

[15]Schmidt G,Thannhauser S. A method for the determination of deoxyribonucleic acid, ribonucleic and phosphoproteins in animal tissues.Biol.Chem,1945(161):83.

[16]Krishnan PS, Damle SP, Bajaj V. Studies on the role of metaphosphate in molds.Ⅱ.The formation of soluble and insoluble metaphosphate. Arch. Biochem.Biophys,1957(67):35.

[17]Miyachi S, Kanai R, Mihara S,et al. Metabolic roles of inorganic polyphosphates in Chlorella cells.Biochim.Biophys.Acta,1964,93(3):625-634.

[18]Kanai R, Miyachi S, Miyachi S. Light-induced formation and mobilization of polyphosphate “C” in Chlorella cells. Plant Cell Physiol.(Tokyo), special issue.Studies on microalgae and photosynthetic bacteria,1963(2):613-618.

[19]Eixler S, Selig U, Karsten U. Extraction and detection methods for polyphosphate storage in autotrophic planktonic organisms.Hydrobiologia，2005(533):135-143.

Detection methods of polyphosphate in algae

Yan Bin

(CollegeofCityConstruction&EnvironmentEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)

Made a simple summary on the detection methods of polyphosphate in algae. It contained two aspects, such as staining and chemical extract methods. The advantages and disadvantages of different methods were discussed. It was useful for research development in algal polyphosphate.

polyphosphates, algae, staining, chemical analysis

1009-6825(2015)18-0204-03

2015-04-14

闫 彬(1989- )，男，在读硕士

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