杨国宗综述，杨丽阳审校

(漳州市中医院检验科，福建 漳州363000)

近年来，随着经济发展和生活方式的改变，2型糖尿病(T2DM)发病率在我国呈现逐渐升高的趋势。T2DM是一种遗传因素和环境因素共同作用而形成的多基因遗传的复杂性疾病，并以胰岛素分泌受损和(或)胰岛素抵抗为主要的临床特点，其遗传方式属于常染色体多基因隐性遗传，由于异常基因的遗传使后代具有糖尿病易感性。随着单核苷酸多态性(SNP)分析技术的发展以及全基因组关联研究结果的相继报道，至今已发现许多常见基因变异与T2DM密切相关，但其病因、发病机制未能完全阐明。据统计，目前全球糖尿病患者约3.66亿，估计到2030年将有5.52亿，其中T2DM 至少占95%以上[1]，因此利用高效率、高通量、低成本的SNP分析技术来发现糖尿病易感基因并对其进行相关研究，为T2DM的早期预测并及时做好防治措施具有非常重要的意义。我们以SNP为线索，将其在T2DM发病机制研究中的应用进展作一综述。

1 SNP概况

SNP是指由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。在遗传学分析中，SNPs作为第三代遗传标记，在科研中得以广泛应用。人类染色体大量存在SNP位点，近年来的研究发现有些SNP引起包括糖尿病、肿瘤等在内的各种疾病相关基因表达,有些SNP不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病的致病基因相邻，也可以作为某些疾病的重要标记，由于存在着 SNP，造成人类对有些疾病的易感性、对药物反应性及耐受性的个体差异。另外，SNP具有的高频性、稳定性特征对疾病发生的相关因素分析也是非常重要[2]。随着现代技术的进步，利用SNP发现疾病相关基因突变比通过家系遗传谱的研究容易得多。由于SNP主要是二等位多态性，在基因组筛选中SNPs只需+/-的分析，而不必分析片段的长度，这有利于筛选或检测SNPs的自动化，达到快速、规模化筛查的目的。SNPs在人群中几乎为双等位基因标记，其等位基因频率容易估计，同时也易于进行基因分型方面研究。

2 SNP的主要检测平台

2.1 低通量 包括限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、DNA 测序法、变性高效液相色谱(DHPLC)等，其中以DHPLC技术为主要代表，它是在单链构象多态性和变性梯度凝胶电泳基础上发展起来的一种新的杂合双链突变检测技术，其主要原理是先对目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，通过带正电荷的流动相将带负电荷的DNA分子吸附到固定相上，在不完全变性的条件下，含错配碱基的杂合异源双链比完全配对的同源双链和固定相的亲和力弱，更易从分离柱上洗脱下来，从而达到分离的目的。实验样本中SNPs是否存在，则最终表现为色谱峰形或数目差异，进而检测目的DNA的碱基变异，一般与直接测序法合用。在临床应用过程中，DHPLC技术筛查未知SNPs具有检测效率高、成本低、易于操作和快速准确等优点，因此在人功能基因SNPs研究中得到较好应用[3]。值得注意的是，DHPLC检测也有一些不足，首先是对所用的试剂和环境要求较高，容易产生误差；其次，该技术不能检测出纯合突变。总的来说，该技术很大地促进了新突变位点的发现，并对了解疾病发生发展机制，确定药物研发方向做出了重要贡献。

2.2 中高通量 主要有SNPstream技术、SNP lexTM Assay、基因芯片技术、MassARRAY-IPLEX技术。基因芯片技术有着信息量大、自动化、成本低、有一定的特异性等优点，但其检测灵敏度低、重复性较差、分析范围窄等不足。MassArray飞行时间质谱生物芯片系统是为基因组学研究提供兼顾灵敏度和特异性的中高通量技术平台，是目前唯一采用质谱法进行直接检测的设备。MassARRAY-IPLEX SNP检测系统基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术[4]，该技术是Sequenom公司推出的世界领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术结合，实现基因分型检测，分型结果准确性高，因此在SNP的基因分型具有重要的意义。其主要特点是序列特异引物在SNP位点上延伸1个碱基，然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒强激光激发，基质将吸收的激光脉冲能量转移给待分析样品，按质荷比加以分离。离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、T、G和C的信号强度及毗邻信号间分子量差异可得出模板序列的一维信息，从而实现SNP分型的目的。MassARRAYTM系统反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，不需要各种标记物，其采用的高密度SpectroCHIPTM点阵芯片可以快速完成多重性鉴定，具有很大的灵活性，高度的准确性，在大量样本的高通量检测中得到较广的应用[5]。

2.3 高通量 包括高温连接酶检测反应 (LDR)、Taqman探针技术、高分辨熔解曲线(HRM)基因突变检测/分型系统等。新型LDR寡核苷酸芯片利用了LDR原理，即当高温连接酶检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配时连接反应就不能进行，从而实现对基因多态性位点的识别。利用该原理，该技术大大提高了分型准确性，从而使得T2DM易感基因分型得到更好的应用。Taqman探针技术也是目前应用较为广泛的一种分析技术，该技术的优点在于反应在PCR过程中进行，无需分离或洗脱过程，从而减少了可能的PCR污染。此外，扩增产物分析具有简便、快捷、准确、无需电泳，提高了实验速度。HRM基因突变检测/分型系统在5分钟即可完成96/384孔板PCR产物样品突变检测，尤其用于测序前的大规模突变筛查及基因分型工作，使测序的工作量降低为原来的1%。

3 SNP在T2DM易感基因筛选中的应用

目前，国际上共报告了40多个糖尿病易感基因。Scott LJ等[6]通过对SNPs的关联分析后，发现了4个与T2DM有关的易感基因，它们分别是定位在9号染色体上的CDKN2A、CDKN2B基因，以及定位在 3号染色体上的 IGF2BP2、CDKALl基因。我国也开展了相关易感位点的研究，报告了几个候选易感基因。早在2003年，骆天红等[7,8]通过收集大量T2DM患病同胞家系，利用人类多态性研究中心公布的微卫星位点，对这些家系进行全基因组扫描和连锁分析，发现了中国汉族人T2DM的一些易感基因位点，他们还对102个华东地区汉族人T2DM家系 (其中包括糖尿病患者282人，74个家系有2个糖尿病同胞，18个家系有3个糖尿病同胞，10个家系有4个糖尿病同胞)的SNP关联分析和全基因组扫描研究，结果显示这些人的9号染色体上D9S171、D9S175同T2DM有连锁倾向。Wen J等[9]也证实了以往发现的另外6个T2DM易感基因，分别是 TCF7L2、SLC30A8、HHEX、PPARG、KCNJl、FTO 基 因 ， 这 些 基 因 与T2DM发生和发展的风险性增高相关。后来，我国有学者研究发现SLC30A8基因与中国汉族人T2DM和空腹血糖受损及糖调节受损相关，SLC30A8基因CC基因型患T2DM的风险显著增加[10,11]。对于血糖的调节因子胰岛素及其受体的相关基因研究中，Malecki等[12]人发现2号染色体长臂近末端处D2S126附近的糖尿病候选基因NEURODl杂合突变同T2DM相关，该基因编码的蛋白同HLH蛋白E47形成异二聚体后，可同胰岛素基因启动子上的E-box序列结合，从而调控胰岛素的分泌。另一个重要的候选基因胰岛素受体底物1基因，由于该基因编码的蛋白质在胰岛素信号转导过程中起重要作用，其某些特殊等位基因同T2DM相关。糖代谢中与血脂转化因素相关基因研究中，焦红肖[13]等对天津地区1463名无血缘关系的人群研究发现了5个SNP位点与T2DM显著相关，分别为 CDKN2A/B、CDKAL1、LPHN3、IGF2BP2、ABCG2基因。孙志连[14]等对T2DM患者的脂联素基因第45位点单核苷酸多态性(SNP45)分析发现糖尿患者群中G等位基因多见，携带等位基因G的患者血清甘油三脂较高，提示脂联素基因SNP45多态性与T2DM发病及甘油三脂有关。韩景银[15]等研究发现T2DM患者存在血清脂联素、内脂素水平的异常表达，与T2DM颈总动脉IMT值有着显著相关性。

近年来，SNP在T2DM肾病的易感性方面的相关研究比较多。T2DM并发肾病的相关易感基因的研究主要针对T2DM患者微血管病变的各高危因子，包括糖、脂代谢异常相关基因，肾素-血管紧张素系统的基因及其他遗传因素。Gosek K等[16]研究了444例T2DM患者，发现AR基因C-106T多态性是血糖控制不良T2DM肾病的危险因子。McKnight AJ等[17]研究了GREM1基因变异与DN的关系，发现GREM1变异型rs1129456与糖尿病肾病相关。Naresh VV等[18]研究了ACE基因I/D多态性与T2DM肾病关系，研究结果显示DD纯合型与2型糖尿病肾病有关。李颀等[19]对脂氧合酶超家族成员之一ALOX12的基因多态性进行研究，在北方汉族人群中未发现ALOX12基因多态性与T2DM、DN有关。所研究这些可能的易感基因，还有待进一步确定。目前对于T2DM及DN候选基因的研究中存在一部分有争议或矛盾的结论，原因可能与采集的样本过小、种族不同、地域不同、样本不同质性、技术方法不同有关。

总之，随着高效、高通用、低成本的SNP检测技术不断被开发和大规模应用，不同地区不同种族人群的SNPs研究增多，使SNPs数据库的日趋健全，越来越多与T2DM相关的SNPs被发现及T2DM易感基因被确认，将有助于对T2DM及DN发病机制的深入了解。通过先进的高通量分析技术对T2DM患者SNP检测的应用，有助于建立疾病基因分型方法为T2DM的预防提供理论依据，以便早期发现T2DM高危人群，为T2DM患者提供新的预防和治疗选择,同时对实现DN早期预测和防治也具有重要意义。

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