杨泽西，张泽明，王 震，安 蕾

·前沿进展·

结核性胸膜炎实验室诊断方法的研究进展

杨泽西，张泽明，王 震，安 蕾

结核性胸膜炎(TP)是引起渗出性胸腔积液最常见的病因，传统的诊断方法主要为病原学、免疫学和胸膜病理检查。随着科学技术的发展，尤其是药敏试验与分子生物学技术在临床的应用，出现了一些新的TP诊断技术。本文就TP的病原学诊断方法、免疫学诊断方法及分子生物学诊断方法的研究进展进行综述，以期为TP的早期诊断提供参考。

结核，胸膜；实验室诊断；综述

胸腔积液是胸膜疾病的常见临床表现，可由于胸膜自身疾病或其他肺部病变导致，亦可由全身性疾病导致。在我国结核性胸膜炎(tuberculous pleurity，TP)是引起渗出性胸腔积液的常见病因，而明确诊断TP的主要方法有病原学、免疫学和胸膜病理检查 。胸腔积液细菌学检查常为阴性，胸膜活检联合结核菌分离培养可提高TP的诊断率，但仍有15%～20%的假阴性率[1-2]，且胸膜活检和胸腔镜检查因其侵入性而在临床使用受限，因而TP的确诊有时较为困难。目前，临床仍然建议经胸腔穿刺取得胸腔积液标本，根据实验室检查结果对TP进行确诊。本文综述了TP的病原学诊断方法、免疫学诊断方法及分子生物学诊断方法的研究进展，现报道如下。

1 病原学诊断方法

1.1 分枝杆菌涂片染色镜检法 分枝杆菌涂片染色镜检法在世界范围内应用广泛，其局限性为灵敏度低、无特异性，并受样本量和患者病情影响。国内胸腔积液涂片显示结核杆菌涂阳率极低，但HIV患者胸腔积液结核杆菌涂阳率较高[3]。

1.2 分枝杆菌分离培养法 临床上分离培养物可鉴定结核分枝杆菌复合群菌种，并通过药敏试验提供被检患者细菌学诊断结果。分枝杆菌分离培养法诊断TP的灵敏度较分枝杆菌涂片染色镜检法更高[4]，但在培养过程中涉及较多培养基，选择时应仔细考虑。

1.3 分枝杆菌快速培养法 为了改善传统罗氏培养法所需时间过长的局限，临床致力于研究分枝杆菌快速培养法，但因结核杆菌生长缓慢是由遗传属性决定的，因此研究方向由促进其快速生长转向快速检出。

1.3.1 显微镜观察药物敏感性检测技术(MODS) Caviedes等[5]通过大量实验并结合前人的经验发现，结核分枝杆菌在液体培养基中生长速度较固体培养基快，同时结核分枝杆菌在液体培养基中生长时会出现特征性索状结构，该结构容易在显微镜下观察到。根据这一特性，Caviedes等开发了MODS。Arias等[6]报道显示，MODS检测结核分枝杆菌的灵敏度、特异度分别为97.5%、94.4%；其出现阳性结果的中位时间为5～10 d，较改良罗氏培养法(平均21 d)短。黄自坤等[7]研究结果显示，MODS检测吡嗪酰胺(PZA)耐药性的灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值和阴性预测值分别为95.7%、88.4%、92.9%、93.0%和92.7%。

1.3.2 分枝杆菌生长指示管法(mycobacteria growth indicator tube，MGIT) MGIT可以进行分枝杆菌的培养及鉴定药敏系统，该法对分枝杆菌阳性检出时间为2周。Koh等[8]研究结果提示，在主要抗结核药敏试验中，MGIT和利用琼脂标准培养法具有非常好的一致性。

1.3.3 硝酸盐还原试验(NRA) 结核分枝杆菌可将硝酸盐分解为亚硝酸盐及氮氧化物，亚硝酸盐与显色剂反应表现出不同颜色，进而可判断有无结核分枝杆菌生长[9]。Affolabi等[10]利用NRA检测痰中结核分枝杆菌结果生物，表明该法检测利福平(RFP)、异烟肼(INH)、氧氟沙星(OFL)、卡那霉素(KAN)的耐药性符合率分别为93.7%～100.0%、88.3%～100.0%、94.6%～100.0%、100.0%[11]。

1.3.4 噬菌体生物扩增法(PhaB) 利用分枝杆菌噬菌体D29对缓慢生长的结核分枝杆菌及快速生长的耻垢分枝杆菌有亲噬性，让已进入菌体的噬菌体增殖并使菌体裂解，根据噬菌斑推测样本结核分枝杆菌数量。PhaB被用于结核分枝杆菌的快速检测及药敏试验，据Ruan等[12]报道显示，PhaB检测痰中结核分枝杆菌的灵敏度、特异度、准确率分别为82.1%、95.9%、88.6%，但该法用于诊断TP方面的文献较罕见。

2 免疫学诊断方法

2.1 皮肤结核菌素试验 部分首次进行皮肤结核菌素试验阴性的患者会产生“爆发效应”，1周后再次进行皮肤结核菌素试验可出现阳性结果，该法主要用于判定人体对结核分枝杆菌有无免疫力。皮肤结核菌素试验诊断结核病的特异度低，可能与接种卡介苗、非结核分枝杆菌接触后致敏或真正结核致病菌所致有关[13]。

2.2 结核抗体 患者感染结核分枝杆菌后血清特异性抗体IgG、IgM、IgA形成，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定结核抗体可用于结核诊断，IgG、IgM、IgA联合检测可提高诊断的灵敏度。脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)属于特异性抗原，Chan等[14]报道显示，在活动性肺结核中LAM抗体的灵敏度为93.0%、特异度为100.0%，我国学者应用LAM检测活动性肺结核患者的灵敏度为91.7%、特异度为87.8%，其与分枝杆菌涂片染色镜检的符合率为90.2%[15]。由于结核菌表面有很多不同的抗原成分，但何种结核抗原的抗体与疾病免疫应答关系密切尚不清楚，因此将结核分枝杆菌特异性抗原联合或几种特异蛋白融合成多聚蛋白复合物用于检测TP能提高诊断准确率，且不影响诊断特异度，较单一抗原具有更高的灵敏度。基于此，采用结核分枝杆菌7种特异性抗原检测结核抗体，与常规免疫试剂相比较，特异度和灵敏度均有明显提高[16]。郑晓滨等[17]对胸腔积液多克隆抗卡介苗IgM抗体水平进行研究，发现对照组患者胸腔积液多克隆抗卡介苗IgM抗体水平平均值加2倍标准差为诊断界值，其阳性预测值高达96.0%。

2.3 结核抗原 结核抗体检测技术简便，但相比结核抗原检测“窗口期”较长，无法实现早期检测，鉴于此出现了血清学结核抗原检测技术[18]。致病性结核分枝杆菌特异分泌性抗原的存在使早期检测抗原并区分感染与卡介苗成为可能。我国学者已研究制备出单克隆抗体用于诊断结核分枝杆菌感染[19]。有临床研究显示，ELISA测定血清结核抗原的线性范围为0.625～5.000 μg/ml，阴性与阳性标本重复率分别为100%、95%，特异度为96%；在结核抗体阴性患者中，进展期菌阳、菌阴肺结核与肺外结核抗原检出阳性率分别为50%、71%和60%[20]。

2.4 细胞因子

2.4.1 腺苷脱氨酶(ADA) ADA可在大多数细胞中存在，但其主要作用于淋巴细胞，尤其与T淋巴细胞的增殖和分化有关，其活性降低可影响核苷酸合成，导致免疫活性细胞减少。鉴于此，ADA在TP的诊断中具有重要作用。Ogata等[21]研究结果显示，ADA诊断TP的最佳临界值为36 U/L，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为85.5%、86.5%、69.7%、93.6%，但因约1/3肺炎旁积液、淋巴瘤和70%脓胸患者常伴有ADA水平升高，临床应注意鉴别。

2.4.2 可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R) 人体抗结核免疫以细胞免疫为主，细胞免疫因子sIL-2R在人体免疫应答中发挥着重要作用。sIL-2R可作为单个核细胞活化的定量敏感指标，有助于活动性肺结核病情的判断。Hara等[22]研究显示，结核病活动期患者血清sIL-2R水平明显高于健康对照组，在抗结核治疗过程中监测血清sIL-2R水平可反映疾病动态，但临床关于sIL-2R治疗和预防结核病的研究不多，仍需进一步探讨。

2.4.3 干扰素γ(IFN-γ) TP患者胸腔积液中淋巴细胞受结核菌细胞壁蛋白刺激产生IFN-γ，后者激活吞噬细胞并增强对细菌的杀伤力，在局部抗分枝杆菌感染中具有防御作用，因此TP患者外周血IFN-γ水平较低、胸腔积液中水平较高。有临床研究提示，胸腔积液中IFN-γ水平诊断TP的特异度与ADA相似，但灵敏度和准确率则高于ADA[23]。干扰素γ释放试验(IGRAs)包括基于全血的ELISA和基于外周血淋巴细胞的酶联免疫斑点试验，后者又称为结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)。刘国辉等[24]采用T-SPOT.TB检测血液中致敏T淋巴细胞，结果显示其灵敏度(93.3%)和特异度(95.5%)均较高，而胸腔积液中IFN-γ水平诊断TP的灵敏度为97.3%、特异度为90.0%、准确率为95.7%。IGRAs与其他方法比较，其优势为与卡介苗及非结核性分枝杆菌发生相关的交叉反应，但不能区别潜在型肺结核与活动性肺结核[25]。Lange等[26]研究结果显示，体外IGRAs的灵敏度不受HIV感染的影响，但依赖于艾滋病的进程，晚期艾滋病患者因T淋巴细胞缺失而影响体外IGRAs结果。体外IGRAs在低龄儿童中的应用报道很少。

总之，选择特异度和灵敏度均高的TP早期检测技术及试剂，对TP的早期诊断、及时隔离和治疗、有效切断传染途径、降低发病率和病死率至关重要。

3 分子生物学诊断方法

目前，TP常用的分子生物学诊断方法有聚合酶链反应(PCR)测序、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)初步鉴定法等。

3.1 PCR测序 PCR测序是鉴定分枝杆菌的“金标准”，但在不同地区诊断肺结核的灵敏度、特异度有差异。脱氧核糖核酸聚合酶链反应(TB-DNA-PCR)可用于TP的诊断，外周血PCR及胸腔积液PCR诊断TP的符合率分别为83.3%和53.7%[27]，均高于抗酸染色法，且所需时间较短。目前，TB-DNA-PCR常作为其他方法的辅助参考，但不适合分析数量较大的临床标本。

3.2 PCR-RFLP PCR-RFLP通过检测DNA于限制性内切酶切割后形成的特定DNA片段大小而判断基因是否出现突变，但该法操作繁琐，目前应用较少[28]，且其仅能对部分菌种进行鉴定，重复性稍差。

3.3 PCR-SSCP 单链DNA于低温条件下会呈现出由内部分子相互作用形成的二级结构，单个碱基突变可引起DNA于非变性凝胶内的迁移率发生改变。Sheen等[29]检测163株耐吡嗪酰胺结核分枝杆菌发现，PCR-SSCP的灵敏度与特异度分别为85.0%、96.0%；此方法只适用于检测基因是否发生突变，不能阐述突变原因，可鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，但非结核分枝杆菌菌种之间的鉴别诊断仍在探索中。

最后，关于TP实验室诊断方法，笔者总结如下：(1)由于受医院条件限制，临床常无法应用较先进的实验室检查方法检查胸腔积液；(2)目前，临床诊断TP倾向于多因素分析，但究竟将哪种检查方法作为主要参考依据尚无统一结论；(3)细胞因子在TP的发生、发展过程中具有非常重要的作用，随着研究的深入，相信细胞因子将为TP的诊断、治疗及控制传播提供一条新的途径；(4)通过实验室检测胸腔积液，并提供药敏试验结果，将有助于TP的诊断及治疗。

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(本文编辑：谢武英)

·指南·共识·标准·

欧洲心脏病学会(ESC)2015指南：肺动脉高压诊疗要点

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是指肺动脉压力升高超过一定界值的一种血流动力学改变和病理生理状态，可导致右心衰竭，其可以是一种独立疾病，也可以是并发症，还可以是综合征。PH的血流动力学诊断标准为：海平面静息状态下经右心导管检测显示肺动脉平均压≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。以下为欧洲心脏病学会(ESC)2015指南中涉及的肺动脉高压诊疗要点。

◆关于PH诊断策略的建议

1.建议将超声心动图作为一线的无创实验室诊断检查以排查可疑PH(Ⅰ级推荐，C类证据)。

2.对于不明原因的PH患者，建议行通气/血流灌注或肺灌注扫描，以排查慢性血栓栓塞引起的PH(Ⅰ级推荐，C类证据)。

3.对可疑慢性血栓栓塞引起的PH患者，建议行肺动脉增强CT造影检查(Ⅰ级推荐，C类证据)。

4.建议对PH患者行常规生化、血液、免疫、HIV和甲状腺功能检查，以排查特定疾病(Ⅰ级推荐，C类证据)。

5.建议对PH患者行腹部超声检查以筛查肝门静脉高压(Ⅰ级推荐，C类证据)。

6.对于PH患者，建议其初始检查中加入包括一氧化碳肺弥散量检查的肺功能检查(Ⅰ级推荐，C类证据)。

7.可以考虑对所有PH患者行高分辨率CT检查(Ⅱa级推荐，C类证据)。

8.对于可疑慢性血栓栓塞引起的PH患者，可以考虑肺动脉造影(Ⅱa级推荐，C类证据)。

9.不建议PH患者行开胸检查或经胸腔镜肺活检(Ⅲ级推荐，C类证据)。

◆关于评估PH严重程度和临床治疗反应性的建议

1.建议根据临床评估、运动测试、生化标志物、超声心动图和血流动力学检查结果评估PH患者病情严重程度(Ⅰ级推荐，C类证据)。

2.建议每3～6个月对病情稳定的PH患者进行定期后续评估(Ⅰ级推荐，C类证据)。

3.建议使治疗反应良好的所有PH患者达到或维持低危状态(Ⅰ级推荐，C类证据)。

4.建议使治疗反应不够好的大部分PH患者达到或维持中危状态(Ⅱa级推荐，C类证据)。

◆关于PH患者一般治疗的建议

1.避免妊娠(Ⅰ级推荐，C类证据)。

2.采用免疫疗法治疗流感和肺炎球菌感染(Ⅰ级推荐，C类证据)。

3.采用社会心理支持治疗(Ⅰ级推荐，C类证据)。

4.在药物治疗基础上进行运动锻炼(Ⅱa级推荐，B类证据)。

5.对于WHO功能分级为Ⅲ级和Ⅳ级以及动脉血氧分压<8 kPa(60 mmHg)的PH患者进行In-flight O2(Ⅱa级推荐，C类证据)。

6.建议进行择期手术的PH患者采用硬膜外麻醉而不是全身麻醉(Ⅱa级推荐，C类证据)。

7.不建议PH患者进行高强度运动(Ⅲ级推荐，C类证据)。

◆关于PH患者支持治疗的建议

1.有右心衰竭和体液潴留的PH患者应进行利尿治疗(Ⅰ级推荐，C类证据)。

2.PH患者动脉血氧分压持续<8 kPa(60 mm Hg)时应进行持续氧通气治疗(Ⅰ级推荐，C类证据)。

3.建议特发性PH、遗传性PH和多环芳烃类药物所致PH患者采用口服抗凝药物(Ⅱb级推荐，C类证据)。

4.除非合并高血压、冠心病或左心衰竭，否则不建议PH患者采用血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和β受体阻滞剂(Ⅲ级推荐，C类证据)。

(来源：丁香园)

Research Progress on Laboratory Diagnostic Methods for Tuberculous Pleuritis

YANGZe-xi，ZHANGZe-ming，WANGZhen,etal.

HebeiUniversity，Baoding071000，China

Tuberculous pleurity(TP)is the most common cause of exudative pleural effusions，its traditional laboratory diagnostic methods mainly includes etiology examination，immunology examination and pleura biopsy.With the development of science and technology，especially the clinical application of drug sensitive test and molecular biological techniques，some new laboratory diagnostic methods for TP occurred.This paper reviewed the research progress on etiology diagnostic method，immunological diagnostic method and molecular biological diagnostic method for TP，in order to provide references for early diagnosis of TP.

Tuberculous，pleural；Laboratory diagnosis；Review

071000 河北省保定市，河北大学(杨泽西，王震，安蕾)；河北大学附属医院呼吸科(张泽明)

杨泽西，张泽明，王震，等.结核性胸膜炎实验室诊断方法的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(8)：7-10.[www.syxnf.net]

R 526

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.08.003

2015-06-04；

2015-08-14)

Yang ZX，Zhang ZM，Wang Z，et al.Research progress on laboratory diagnostic methods for tuberculous pleuritis[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(8)：7-10.