刘淑媛，万腊根，闻芳，李欣，张长林

(南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌330006)

阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一种或几种造血干细胞发生PIG-A基因突变，导致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol,GPI)锚蛋白合成障碍，引发细胞膜锚连蛋白缺失，补体活化异常所致的溶血性疾病[1]。目前通过流式细胞仪检测细胞膜表面CD55、CD59的缺失已成为诊断PNH的首选实验方法；但CD55、CD59等补体调节蛋白的表达还会受到其它因素的影响，如骨髓增生异常综合征(MDS)、细胞发育不全等均有可能导致膜蛋白的缺失[2]，因此仍有一定的局限性。随后，Brodsky等[3]发现PNH细胞对气单胞菌溶素抵抗，利用这一特性可区分GPI+和GPI-细胞。经过改进，目前已经可以用荧光标记嗜水气单胞菌溶素前体的变异体(fluorescent aerolysin,FLAER)，使之成为诊断PNH更特异的方法。我们利用流式细胞仪对临床患者的血标本进行FLAER及CD55、CD59检测，对其结果进行比较，以探讨FLAER检测在PNH诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 所有患者均为南昌大学第一附属医院2013年至2014年的门诊或住院患者。其中PNH患者10例，经补体相关溶血试验及流式细胞术检测确诊；非PNH贫血患者37例，均为缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血等营养不良性贫血患者。

1.2 仪器与试剂 美国Beckman-Coulter公司FC500 型流式细胞仪 (FCM)，CD14-ECD、CD24-PC5、CD55-PE和CD59-FITC荧光标记单克隆抗体、FLAER试剂及红细胞裂解液均购自美国Beckman公司。

1.3 方法

1.3 .1 外周血红细胞CD55、CD59检测 EDTA抗凝外周血标本以生理盐水稀释，调整红细胞数为109/L；取30μl红细胞悬液于流式专用试管中，分别加入3μlFITC标记的鼠抗人CD59和3μlPE标记的鼠抗人CD55抗体，混匀后室温避光标记15min；生理盐水洗去游离抗体，加入600μl生理盐水悬浮细胞，用流式细胞仪测定细胞表面抗体标记率。

1.3 .2外周血粒细胞、单核细胞FLAER检测 取30μl全血分别加入 2μlFLAER 试剂、3μlECD 标记的鼠抗人CD14和3μlPC5标记的鼠抗人CD24抗体，混匀后室温避光标记15min；加入200μl红细胞裂解液，室温孵育10min，生理盐水洗涤2次，加入600μl生理盐水悬浮细胞，用流式细胞仪测定细胞表面抗体标记率。

1.3 .3统计学分析 用SPSS17.0软件进行数据分析，数据用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PNH患者外周血红细胞CD55、CD59抗原缺失表达 经流式细胞仪检测，非PNH贫血患者的外周血红细胞表面抗原CD55、CD59均未见明显表达缺陷，结果显示CD55、CD59仅存在单一表达峰 (见图 1A、1B)；CD55－占 (3.31±4.26)%，CD59－占(0.78±1.39)%。 PNH 组中 2 例 CD55－、CD59－＜5%，8例患者外周血中同时存在正常及CD55、CD59缺陷的2群红细胞，部分患者在弱阳性区可见一群细胞，为CD55/CD59部分缺陷的红细胞(见图1E)；红细胞膜CD55、CD59抗原表达缺失率分别为(35.54±21.91)%和(32.32±22.04)%，与非 PNH 贫血组比较明显升高(P＜0.05)，见表 1。

图1 PNH患者和非PNH贫血患者外周血红细胞CD55、CD59检测

表1 PNH组和非PNH贫血组外周血细胞抗原缺失率(x±s，%)

2.2 PNH患者外周血FLAER检测分析 通过多参数流式细胞术检测，分别采用CD14、CD24对外周血单核细胞、粒细胞进行靶向标记，结果显示，PNH患者外周血粒细胞FLAER阴性率达 (82.52±25.24)%，单核细胞FLAER阴性率达 (79.84±19.86)%；与CD55、CD59的阴性率相比，有显著升高 (P＜0.05)。其中6例PNH患者同时伴有CD24、CD14抗原的缺失(见图2A、2B)。对于PNH患者，FLAER分析检出率达100%；而CD55、CD59抗原缺失检测存在2例阴性结果(如图3所示)。非PNH贫血患者外周血粒细胞和单核细胞均为FLAER阳性(见图2C、2D)。由此可见，外周血FLAER检测的敏感性和特异性均比CD55、CD59检测更好。同时，与传统的CD55、CD59相比，FLAER分析法区分的GPI+和GPI－2群细胞也更直观，易于分辨(图2 所示)。

3 讨论

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性红细胞膜缺陷性疾病，临床表现主要为清晨酱油色尿，慢性血管内溶血，可伴有全血细胞减少和反复血栓形成[4]。传统诊断PNH常用的方法有Ham试验、蔗糖溶血试验、尿Rous试验等；但这些方法敏感性、特异性差，容易受到其它因素的影响，如PNH发作时呈典型的血管内溶血，Ham试验阳性具有诊断价值[5]，而对于缓解期临床症状好转的病人，Ham试验等溶血性贫血相关试验常呈阴性，易造成漏诊。

图2 PNH患者和非PNH贫血患者外周血粒细胞、单核细胞的FLAER分析

图3 对1例PNH患者外周血细胞FLAER与CD55、CD59检测比较

20世纪80年代以来，对PNH的研究逐步深入，该病的发生机制被证实是由于造血干细胞发生PIG-A基因突变，导致糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白合成障碍，造成血细胞表面锚连蛋白的缺失，红细胞因表面缺乏补体调节蛋白如CD55、CD59而对补体敏感[1]。而PNH患者的多数临床表现均可归因为受累细胞表面此类蛋白的缺乏。因此通过流式细胞术检测细胞表面补体调节蛋白CD55、CD59逐渐成为诊断PNH的金标准，并可以对PNH血细胞进行定量分析[6]。随着研究的不断深入，学者发现很多干细胞疾病(如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等)和免疫性疾病(如系统性红斑狼疮等)患者中均可检出 CD55－/CD59－细胞[7-9]，CD55、CD59检测对于PNH的诊断仍有一定的局限性。在这种情况下人们找到了FLAER分析法弥补其不足。1999年，Brodsky等[3]发现PNH细胞对气单胞菌溶素抵抗，利用这一特性可区分GPI+和GPI-细胞。经过改进，用荧光标记嗜水气单胞菌溶素前体的变异体 (fluorescent aerolysin,FLAER)，使之特异性地与细胞膜上的GPI锚连蛋白结合而直接反映锚连蛋白的缺失情况。因此FLAER诊断的特异性与其它靶向标记抗原相比较而言有所提高。

本研究中，我们采用流式细胞术对10例PNH患者和37例非PNH贫血患者进行检测，结果表明FLAER对区分正常和异常的细胞群更加明显，并且非PNH患者FLAER呈100%阳性，而CD55－占(3.31±4.26)%，CD59－占 (0.78±1.39)%。 由此说明FLAER分析法较CD55、CD59检测假阴性率低，特异性好。通过对FLAER和CD55、CD59检测结果进行比较，对于PNH患者，FLAER分析检出率达100%；而CD55、CD59抗原缺失检测存在2例阴性结果 (如图3所示)。这2例患者外周血红细胞CD55－、CD59－＜5%， 而 FLAER 检测粒细胞阴性率分别为67.3%、17.4%，单核细胞阴性率分别为54.3%、52.5%，明显存在GPI锚连蛋白的缺失。造成这一结果的原因一方面可能是PNH患者处于发作期，呈典型的血管内溶血的临床表现，红细胞溶解而影响红细胞表面抗原检测结果；另一方面可能是贫血患者采用输血作为治疗手段，导致CD55、CD59缺陷红细胞稀释而影响检测结果。同时，由于红细胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好地与锚连蛋白结合，因此我们首先利用CD24和CD14对粒细胞和单核细胞进行靶向标记，再进行FLAER分析。这样提高了FLAER检测的敏感度，避免输血或溶血导致的PNH克隆的减少，对于PNH的诊断更有意义。此外，我们发现PNH患者外周血中粒细胞FLAER阴性率达(82.52±25.24)%，单核细胞 FLAER阴性率达(79.84±19.86)%，PNH 克隆数明显大于 CD55、CD59抗原检测。进一步说明与CD55、CD59检测相比，FLAER技术对PNH诊断具有更大的优势。

目前已证实PNH的发生是由于造血干细胞PIG-A基因突变所致，PNH克隆可累及几乎所有血细胞；本研究结果显示在10例PNH患者外周血中，红系PNH克隆数均明显低于粒系和单核系，说明红系的PNH克隆检测并不能完全反映患者的真实情况，这可能与红细胞寿命较短有关。因此，FLAER对白细胞的分析能够更可靠地反映PNH克隆情况，这对PNH微小克隆的检测、PNH血栓形成的风险评估及其治疗具有重要意义。

综上所述，FLAER技术对PNH的诊断比CD55、CD59检测更加特异、敏感、直观；FLAER分析更能反映PNH克隆的变化情况，对PNH微小克隆的检测及治疗具有重要价值。

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