刘志刚,冯海峰,庄俊涛,刘勉

山东农业大学体育与艺术学院,山东泰安271018

农业院校高水平运动员肠道菌群区系与身体素质的关系探讨

刘志刚,冯海峰,庄俊涛,刘勉

山东农业大学体育与艺术学院,山东泰安271018

为研究农业院校高水平运动员肠道菌群区系与身体素质的关系，解决运动性胃肠综合征问题，提高运动员的竞技水平，通过采集山东农大不同来源运动员的新鲜粪样，对胃肠道正常菌群进行分离鉴定，并对分离的优势菌乳酸杆菌进行16 SrRNA分析；同时将正常菌群优势菌研制成口服液，安全性检测合格后用于受试者，连续服用10 d，每日1次，观察运动员胃肠道菌群的变化及其与身体素质的关系。结果表明：运动员肠道中的优势菌群为乳酸杆菌、双歧杆菌、消化球菌和肠球菌，且异性之间肠道正常菌群平均值差异显著（P＜0.05），同性不同区域之间差异不显著（P＞0.05）；对4株乳酸杆菌嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus、鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus和唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius16SrRNA检测分析，并与Genbank上公布的序列分析，同源性分别为99.2%，99.1%，99.8%和98.9%。受试运动员服用微生态制剂后，胃肠功能、运动持久力、抗感冒的能力均明显增强，抗疲劳能力增强0.7～1.1 h。由此可见运动员肠道菌群区系与身体素质关系密切，坚持服用微生态制剂可以明显提高运动员的运动能力，解决运动性胃肠综合征问题，为提高运动员的水平提供理论依据。

农业院校;运动员;肠道;正常菌群;微生态制剂;身体素质

人体是一个复杂的有机体，各个功能系统之间都是相辅相成，密切联系的。应激反应是不断变化的外界条件所引起的机体功能状态的适应性变化。在某种意义上，人体的胃肠道也是控制和调节运动员适应和再生能力系统的一部分。平衡的胃肠免疫系统以及积极的免疫活性可以使运动员抵御有害病原体的侵害。在运动过程中，机体所发生的一系列的变化将会导致胃肠系统的功能及其结构的变化，降低胃肠道对体液及营养物质的吸收，导致脱水和能量贮存不足，从而影响运动员的运动能力。

近年来，随着高校高水平运动员的增多，锻炼项目及锻炼强度的增加，运动员常常出现运动后身体不适，尤其是胃肠功能的问题[1]。人们己经很多地了解到有关体育运动对心肺功能及内分泌系统的影响，而体育运动与胃肠微生物区系的关系却知之甚少。胃肠道微生物对维持人类健康起着重要作用，而且与胃肠综合征的发病有着一定的联系[2,3]。经常从事体育锻炼，对胃肠道的机能有良好影响，可以使胃肠的蠕动增强，消化液的分泌增多，因而提高了消化和吸收的能力，使人的食欲增加，有利于增强体质。但是，剧烈的紧张性运动则会导致胃肠功能紊乱，引起呕吐、腹泻等不良症状，这在运动员，尤其是耐力运动员中尤为常见。运动员肠道微生物菌群结构的研究将会给运动性胃肠综合征发生机制的研究提供许多有价值的信息和思路[4-7]。本研究以山东农业大学高水平运动员为研究对象，目的在于探索高水平运动员胃肠道微生物区系与人体素质的关系，解决运动性胃肠综合征问题，为提高运动员的水平提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

恒温培养箱（WS2-134-65,HH B11 420），上海市跃进医疗器械一厂生产；厌氧菌培养箱（YQX-II），上海康华生化仪器制造厂生产；光学显微镜（OLYMPUS,CH-2），JAPAN生产；电子天平(asleep EY-300A),JAPAN生产；微量移液器，德国Eppendorf公司生产。

1.2 主要试剂

革兰氏染色液，微量生化反应管，上海医学化学试剂厂生产；FS、ES、PS、BLb、MRS、BDS、EC、SP、Emb等培养基购自天津东方卫生材料厂；硝酸盐还原培养基、明胶液化培养基、蛋白胨水培养基、硫化氢试验培养基购自上海生物工程公司。

1.3 运动员胃肠道正常菌群的分离鉴定

采用随机抽样的方法，抽取山东农大高水平运动员40名(其中男女各20名)，在其训练前，分别采集1克新鲜粪样，按常规细菌分离培养方法进行细菌分离并鉴定。

1.4 运动员胃肠道微生物优势菌16SrRNA分析

采用随机抽样的方法，抽取山东农大运动员(其中男女各10名)，在其训练前后，分别采集1 g新鲜粪样，并对样品进行预处理，提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR反应体系为25 μL，即ddH2O 16 μL、10×buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、上下游引物各0.5 μL(引物浓度为25 pmol/μL)、模板1.0 μL、酶0.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min，然后进入94℃变性30 s、56.0℃退火30 s和72℃延伸2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物经与pMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌，重组质粒鉴定为阳性的送南京金斯瑞科技有限公司测序，将所得到的序列与Genbank中的16S rDNA序列进行分析比较。

1.5 益微生态制剂对运动员身体素质的增强作用

将分离获得的胃肠道正常菌群通过比较分析，筛选优势菌株，经一定工艺研制成微生态制剂口服液。为了确定受试运动员服用微生态制剂口服液的胃肠功能、运动持久力（抗疲劳能力）、抵抗感冒能力，由教练制定训练计划，使受试者完成定量的运动负荷，通过对照服用微生态制剂前后，受试者对同样强度的疲劳运动负荷一系列生理生化反应，观察微生态制剂口服液的抗疲劳效果，试验组受试者服用10 d微生态制剂，每日1次，午餐前服用，比较服用微生态制剂前后同一组运动员的身体素质的变化。

2 结果

2.1 高水平运动员肠道菌群鉴定结果

2.1.1 选择性培养基上的菌落特征观察选择性培养基上的菌落特征（见图1），结合杨景云(1997)报道的鉴定方法，根据各菌落的特征初步对其菌属进行确定，结果见表1。

2.1.2 选择性培养基上细菌的形态特征挑取选择性培养基上目的菌进行革兰氏染色，镜检观察，参考东秀珠（2001）的鉴定方法，对挑取细菌的形态特征进行对照，进一步对菌属进行确定，结果见表2。

图1 各种细菌在选择性培养基上菌落的形态Fig.1 Colony morphology of bacteria on selective medium

表1 各选择性培养基上菌落的特征Table 1 Colony characteristics of bacteria on seclective medium

表2 选择性培养基上细菌的形态特征Table 2 Characteristics of bacteria on seclective medium

2.1.3 选择性培养基上细菌的生化特征将选择性培养基上分离到的各种细菌纯培养之后，分别进行生化试验，结果见表3。

表3 各种细菌的主要生化特征Table 3 The main biochemical characteristics of various bacteria

2.2 不同来源运动员粪便中正常菌群的数量

对抽取的山东农大运动员来自农村和城市男女各10名，检测的正常菌群的数量见表4。

表4 不同来源运动员粪便中正常菌群的数量(nlog10/g粪样)Table 4 The number of normal flora in feces of different athletes(nlog10/g feces)

由表4分析，运动员肠道中的优势菌群为乳酸杆菌、双歧杆菌、消化球菌和肠球菌；运动员肠道正常菌群经统计学分析10名来自城市的男运动员平均值与10名来自城市的女运动员平均值及10名来自农村的女运动员平均值差异显著（P＞0.05），与10名来自农村的男运动员平均值差异不显著（P〉0.05）；10名来自农村的男运动员肠道正常菌群平均值与10名来自城市的女运动员平均值及10名来自农村的女运动员平均值差异显著（P＞0.05）。

2.3 运动员胃肠道优势菌16SrRNA结果

2.3.1 分离菌的16S rRNA鉴定结果由图2表明，1～4菌株的16S rRNA基因序列长度均为1500 bp，与标准菌株相同。

图2 分离菌株的16S rRNA基因扩增图Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA geneM:Marker，1-4为SL-1、SL-2、SL-3和SL-4分离菌株，5为标准株（LB1）M:Marker;1-4 Lactobacilli isolate SL-1,SL-2,SL-3,SL-3 and SL-4; 5:Standard Lactobacilli DNA sample（LB1）

2.3.2 PCR产物测序结果将PCR产物测序，并在Genbank上进行Blast分析，结果显示，SL-1、SL-2、SL-3、SL-4株分别属于嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、卷曲乳杆菌（L.crispatus）、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）和唾液乳杆菌（L.salivarius），它们的同源性分别为99.2%，99.1%，99.8%和98.9%。

2.4 微生态制剂口服液对运动员身体素质的增强作用

由表5可见运动员服用10 d后胃肠功能、运动持久力、抗感冒的能力明显增强，能更好的适应运动带来的应急反应，抗疲劳能力增强0.7～1.1 h，仅1例出现感冒现象。

表5 益生菌制剂的研制及其对运动员身体素质的增强作用Table 5 The development and enhancement on athletes'physical quality of probiotics

3 讨论

近年来，随着全民健身计划的实施，体育运动已经以不同的形式在社会中广泛流行，尤其是在具有健康意识的群体中。有关体育运动对心肺功能及内分泌系统的影响人们己经有了很多的了解，而体育运动对胃肠微生物区系的影响人们却知之甚少。经常从事体育锻炼，对胃肠道的机能有良好影响，可以使胃肠的蠕动增强，消化液的分泌增多，因而提高了消化和吸收的能力，使人的食欲增加，有利于增强体质。但是随着体育竞技运动水平的不断提高，势必要求有高水平的运动训练。运动性胃肠综合征是运动员在高强度、大运动量的运动训练和比赛中造成的机体胃肠功能紊乱的现象，而且也不同程度地妨碍了运动员正常的运动训练和比赛。本研究对抽取的山东农大运动员肠道的正常菌群进行分离鉴定，对定植在胃肠道内的正常微生物区系进行研究，结果发现运动员肠道中的优势菌群为乳酸杆菌、双歧杆菌、消化球菌和肠球菌，对其肠道正常菌群进行统计，结果显示男运动员肠道正常菌群的平均值显著高于女运动员平均值，可见性别不同的运动员肠道正常菌群的平均值差异显著；10名来自城市的男运动员肠道正常菌群平均值与10名来自农村的男运动员肠道正常菌群平均值，以及10名来自城市的女运动员肠道正常菌群平均值与10名来自农村的女运动员肠道正常菌群平均值差异不显著（P＞0.05），可见地区来源不同的运动员平均值差异不显著（P＞0.05）；10名来自城市的女运动员平均值与10名来自农村的女运动员平均值差异显著（P＜0.05）。

近年来，随着微生物生态学的发展，人们注意到定植在胃肠道内微生物菌群区系结构，这个区系主要是由许多细菌组成，它们附着在肠内粘膜上，参与了机体的食物消化、药物代谢、合成维生素和防止外源致病菌入侵肠道，对于维持人类的健康和实现各种生理功能起着非常重要的作用。人体肠道内这些微生物与人体胃肠的功能关系密切[5,7,8]。在研究运动员胃肠功能的变化时，胃肠道的微生物区系是不容忽视的因素[8,9]。通过运动员口服微生态制剂来研究微生态制剂对运动员身体素质的增强作用，结果发现农业大学运动员口服微生态制剂后明显增强了运动员的抗应急、抗疲劳、抗感冒的能力，可见运动员肠道菌群区系与身体素质关系密切，坚持服用微生态制剂可以明显提高运动员的运动能力。这一研究结果不仅有助于解决运动性胃肠综合征问题，进一步阐明运动性胃肠综合征的发病机制，了解和掌握运动中胃肠功能变化的规律，科学地指导体育训练，促进我国竞技体育的发展，而且还将为我国全民健身计划的开展实施提供科学的指导依据。

[1]聂清,薛艳华,王琳,等.佳木斯大学大学生及老年教师正常肠道菌群值的调查[J].黑龙江医药学杂志,2002,25(4):41

[2]乔德才,高峰,李海鹏.运动性胃肠综合征的流行病学特征[J].中国临床康复,2005,9(4):166-167

[3]乔德才,刘瑾彦,赵立平.运动性胃肠综合征研究现状[J].中国运动医学杂志,2004,23(1):73-75

[4]郭本恒.人肠道菌群的生理功能[J].中国乳品工业,2001,29(4):20-22

[5]杨景云.肠道菌群与健康-肠道微生态学[J].哈尔滨:黑龙江科技出版社,1991:135

[6]乔德才,刘瑾彦,陈敬,等.中长跑运动员胃肠菌群区系结构分布特征的微生态研究[J].中国运动医学杂志,2004,23(6):613-616

[7]乔德才,陈敬,魏桂芳,等.采用DNA指纹图谱技术分析中长跑运动员肠道菌群结构特征[J].中国运动医学杂志,2004,23(5):517-521

[8]Versalovic J,Koeuth T,Lupski J R.Distribution of repetitiveDNA sequence in eubacteria and application to fingerprinting ofbacterial genomes[J].Nucleic Acids Res,1991,19(24):6823-6831

[9]Falk P G,Hooper L V,Midtvedt T,et al.Creating and maintainingthe gastrointestinal ecosystem:what we know and need to know from gnotobiology[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998,62(4):1157-1170

The Exploration for the Relationship between Intestinal Flora and Physical Quality of the High-level Athletes in Agricultural Universities

LIU Zhi-gang,FENG Hai-feng,ZHUANG Jun-tao,LIU Mian
Sports and Art College of Shandong Agricultural University,Taian271018,China

For studying Agricultural universities’high-level athletes intestinal flora fauna and physical relationship,solving the problem of gastrointestinal motility syndrome,improving the competitive level of athletes,we collect the fresh fecal samples of athletes from Shandong Agricultural University to isolate and identify the normal flora of the gastrointestinal tract. Lactobacillus,the normal flora dominant bacteria are conducted for 16SrRNA analysis and developed into oral liquid.After safety testing,it used to subjects,taking for 10 days,once a day before lunch,observe the relationship between the changes in athletes’gastrointestinal flora and their physical quality.The results show that the dominant flora in athletes’intestinal are Lactobacillus,Bifidobacterium,Peptococcus and Enterococcus,and the average of normal intestinal flora between heterosexual has a significant difference(P＞0.05),but the difference between different regions of the same sex is not significant(P＞0.05).The four strains ofLactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus rhamnosusandLactobacillus salivariusare conducted for 16SrRNA detection and analysis and compare with the sequence in Genbank:the homology are 99.2%,99.1%,99.8%and 98.9%.After taking probiotics,the gastrointestinal function,exercise endurance and the ability to anti-cold of tested athletes are all enhanced significantly.Besides,the resistance to fatigue is enhanced for0.7-1.1 h.Those show that the intestinal flora fauna of athletes and their physical quality have a close relation.Insisting on taking probiotics can improve the athletes’athletic ability significantly and solve the problem of gastrointestinal motility syndrome.Besides,it can provide a theoretical basis for improving the level of athletes.

Agricultural universities;athletes;intestinal tract;normal flora;probiotics;physical quality

R378.2

:A

:1000-2324(2015)06-0874-06

2013-04-11

:2013-04-25

山东星火计划项目(2008XH080)

刘志刚(1958-),男,副教授,研究方向为阳光体育及足球运动.E-mail:yh1368@sdau.edu.cn