雒思龙，龙 淼

（沈阳工学院 生命工程学院，辽宁抚顺113122）

奶牛乳房炎在世界各国都是影响乳品加工业的最为重要的疾病之一，多见于产后哺乳期的母牛，特别是泌乳期的奶牛更为多见。据统计，乳房炎占奶牛总发病率的21%～23%，全球每年因乳房炎造成的的损失约为350亿美元，其中，由于技术水平和养殖条件等多种因素的制约，我国因乳房炎造成的损失每月就有100亿元。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最常见的致病菌之一，因其造成奶量下降，病乳废弃，甚至由于乳区化脓、坏疽、萎缩以至永久失去泌乳能力，导致奶牛淘汰，每年因乳房炎而被淘汰的奶牛占总淘汰率的9%～10%，而且因为巨大医疗投入给奶牛产业带来了具大经济损失［1－2］。快速高效的诊断一直是直接影响对这类疾病进行治疗的一大难题。肉眼观察乳汁和局部乳房变化可做出初步诊断，实验室诊断法包括化学检验法、物理检验法和血浆中细菌内毒素检测法等。

细菌培养是目前鉴定引起乳房炎致病菌的最佳标准，但是这种方法具有明显的局限性，获得结果受到实验周期和实验成本的限制，并且在收集和处理样品的过程中需要特殊处理。因此，选择优良的能够容易地获得结果并可替代细菌培养的方法是目前的研究方向。作为代替细菌培养方法的新的诊断方法，基于抗原－抗体反应的免疫学诊断方法具有快速、灵敏、特异性高和便携等优势，利用这些理想优势的免疫学诊断方法现已成为用于临床实践中的主要诊断方法，但是结合我国畜牧业现状，尤其是在偏远牧区地方农场，针对隐性乳房炎的免疫学诊断方法仍需大力全面落实推广。

1 葡萄球菌引起的免疫应答

葡萄球菌引起的乳房内感染损害蓄乳池和乳管组织，以及乳腺组织内部。细菌代谢释放毒素和胞外蛋白进而损害乳腺细胞，并将这种作用蔓延到邻近组织。细菌的毒力基因抑制免疫系统，致病菌的持续作用导致乳腺细胞发生生化反应，并形成生物膜促进慢性感染。机体在先天性免疫和获得性免疫的保护下，启动在细胞表面或乳腺细胞内的特定病原模式的识别受体，识别并结合病原相关分子模式的细菌因子［3］，发生抗原－抗体反应，为机体抵御细菌再次入侵做好准备。但是，乳腺上皮细胞由于感染金黄色葡萄球菌或暴露于脂磷壁酸中，而不能维持炎性细胞因子的表达［4］，所以，除了识别受体之外，先天性免疫还依赖于生理生化屏障。致病菌一旦通过这些屏障，先天性免疫就会启动由免疫细胞组分和急性期反应蛋白组成的主动防御机制［5］。如果先天性免疫防御失败，通过获得性反应激活所产生的免疫球蛋白和记忆性细胞，就用于识别特定的抗原决定簇抵御致病菌入侵。此外还有研究表明，在乳腺细胞内灌注金黄色葡萄球菌两周后会延迟抗体水平效价的增长，但抗体效价水平高于产后期感染并低于休乳期感染。

2 免疫学诊断

近年许多研究证实，免疫学检测方法在传染病的快速诊断，特别是在由细菌引起的疾病中的诊断［6－9］很有潜力。利用免疫学诊断的特异性和敏感性，免疫分析是基于抗原与抗体的特异性识别：特异性分析是测定抗体成分区分非目标底物，主要是对基质成分的活性测定［10］；敏感性检测是测定底物的灵敏度。基于免疫原理的测试是一种能够检测超低浓度抗体的检测方法，如凝集反应具有0.4g／mL～0.8g／mL抗体的敏感度并能直接得到阳性反应；酶联免疫吸附试验和放射性免疫分析方法甚至能够检测到介于0.8mg／mL～8mg／mL抗体的更低浓度。

3 葡萄球菌诊断标志物

金黄色葡萄球菌的免疫学诊断方法所面临的主要难题就是鉴定致病菌的最佳抗原。研究已经确定潜在的由葡萄球菌所引起乳房炎的血清学标志物［11－12］，但是由于致病菌在牛体内的遗传变异率较高，而且菌株的多样性也高［13］，以及致病机理较为复杂，金黄色葡萄球菌的多种毒力因子都有可能会影响免疫检测结果。

A 蛋白是一种使用最为广泛的生物标记物，在金黄色葡萄球菌免疫诊断中作为独有检测蛋白。这种由金黄色葡萄球菌A 蛋白基因编码的蛋白在细菌表面识别位点和逃避机体免疫系统中发挥重要的作用［14］。由于在不同的牛科动物细胞培养传代中病原菌株的变异，致病菌的流行病学情况和基因表达变化均会影响测试的灵敏度和辨识度，因此需要寻找类似于A 蛋白的生物标记物［13］。

热稳定核酸酶（校正基因）是另一种金黄色葡萄球菌在核酸和微生物防御及细胞凋亡中发挥重要作用的毒力因子。这种热稳定核酸酶能够出现在所有的菌株中，这也是为什么其用于病原的分子诊断的原因。研究表明，校正基因能够鉴别从其他具有完全特异性的凝固酶阳性的葡萄球菌，从而分离鉴定出金黄色葡萄球菌。然而，使用校正基因的酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测结果显示的特异性（70%）较低，这很可能是由于整体蛋白的免疫机制的影响。但是利用校正基因的聚合酶链反应（PCR）免疫测定的研究，具有得到测试高度特异性的特定金黄色葡萄球菌基因区域的优点。

4 葡萄球菌感染的免疫学诊断方法

4.1 酶联免疫吸附试验

研究人员为检测从怀疑患有乳房炎的奶牛乳汁样品中采集到的金黄色葡萄球菌或其他炎性因子，而研发出了不同类型的酶联免疫吸附试验检测试纸。其中一项最早的专利检测方法是检测金黄色葡萄球菌蛋白的特异性抗体分子量，范围在18ku～26 ku之间。这项测试在20世纪90年代投放市场，作为细菌培养的替代方法。在酶联免疫吸附试验中利用单克隆抗体，使用单分散的固相磁性颗粒作为金黄色葡萄球菌的提取物，获得了完全的灵敏度（100%）。当整个蛋白能够产生抗热稳定性核酸酶的抗体而用于包被到磁性颗粒时，测试性能显著降低，这在检测方法的发展中表明抗原选择的重要性。夹心酶联免疫吸附方法［15］用于专门检测在受人工污染的牛奶中的金黄色葡萄球菌，同时可以用于诊断的由金黄色葡萄球菌所引起的乳房炎。这种检测方法在整个细菌胞体根据不同特性使用两种抗体，以得到更敏感的检测，但是成本昂贵。

4.2 免疫荧光标记技术

为了减少食品样品中的细菌的检出限度，建立了专门结合到A 蛋白的免疫荧光探针。这项技术使用一个有荧光标记的抗体，捕获释放到样品中的金黄色葡萄球菌。通过荧光强度对金黄色葡萄球菌探针进行收集和分析。探针检测作用需要至少103CFU／mL；然而，这种检测在一些情况下是不适用的，因为需要非常专业的设备、训练有素的实验人员和高成本的测试费用。

4.3 免疫凝集试验

免疫凝集检测方法采用乳胶或聚苯乙烯粒子包被在纤维蛋白原和（或）抗体上，当这些分子接触到存在于样本中细菌时，他们形成络合物并沉淀在试管底部。用于金黄色葡萄球菌检测的几种凝集试验已经成功用于人类疾病诊断，而且现已用于检测从患病奶牛乳样中提取的金黄色葡萄球菌。使用6种商品化的可用于针对患乳房炎的乳汁检测的方法，对其测试性能进行了评价：Staphylase试验○R（胰蛋白胨）、Masta金黄色葡萄球菌检测○R（支架诊断）、Staphyloslide乳胶试验○R（流式细胞仪）、Staphytect Plus○R（胰蛋白胨）、干斑Staphytect Plus○R（胰蛋白胨）和标记乳胶凝集试验金黄色葡萄球菌Plus○R（梅里埃公司）。使用Masta金黄色葡萄球菌检测○R取得了最好的效果，利用这一试验取得了86%的敏感性和90%的特异性。然而，这些数值仍然低于人类菌株检测的报道，很可能是由于牛科动物和人类菌株在毒力因子表达上的遗传变异［13］。用在牛科动物上发现的抗体来攻击特异性抗原可以提高测试性能。总体来看，免疫凝集检测方法是一种快速（10 min～20min）、廉价（每个样品约1美元）而且操作简便的检测方法。因此，这是一种在现场诊断由葡萄球菌引起的乳房炎的不错选择。

4.4 横向层流免疫分析

横向层流免疫分析（LFA）也被称为免疫层析试纸测试，是一种容易理解的行之有效的技术，快速而且不需要冷藏，并且能够直接完成对奶牛乳房炎的诊断。这种方法基于免疫层析法，原理是在其中一个样本通过毛细管的作用时结合并传播抗体或特异抗原。这种检测方法最初用于怀孕测试，并已发展成为一个常用的诊断测试平台。一些基于横向层流免疫分析的商品化测试板成本范围在每个样品0.8美元～2美元，而且能在20min内获得结果。

从不同标本中基于横向层流免疫分析的金黄色葡萄球菌试验已获得专利［16－17］。用于检测样品和食品的原料的试纸中的金黄色葡萄球菌是利用纯化多克隆抗蛋白A。横向层流免疫分析进行金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌菌株培养基中生长的初步测试，敏感性和特异性分别确定为100%和93%～100%。当测试应用于人工受污染的食物时，敏感性降至91.6%。这项技术也用于金黄色葡萄球菌的检测。

4.5 免疫聚合酶链反应

聚合酶链反应（PCR）的免疫学检测在金黄色葡萄球菌人工污染的食物样本中得到了发展［18］。在免疫PCR 反应技术中，细菌在样本中由校正基因的前一个区域进行聚合酶链反应捕获扩增得到的多克隆抗体，每一个物种的基因被标记的引物扩增，并且被抗体识别的扩增被固定在硝酸纤维素膜上，这种技术被称为微阵列免疫分析。这种方法用于以下与乳房炎相关病原体的鉴定，金黄色葡萄球菌、牛棒状杆菌、牛支原体、无乳链球菌、坏乳链球菌和乳房链球菌［19］。样本包括内部聚集的聚合酶链反应的扩增子混合物，结合与标记在硝化纤维素垫基部各自的的特殊标记抗体。上述的实验具有高度特性，并可以在3h内获得结果。然而，这些类似于酶联免疫吸附试验和微生物的方法，样品都需要在专门的实验室中进行处理。

目前已有不少关于应用PCR 方法检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素成功的报道，与细菌的常规分离方法相比PCR 方法的敏感性高，而且与其他型葡萄球菌无交叉反应。PCR 方法在金黄色葡萄球菌检测中的应用充分体现了其具有特异性强、敏感性高的特点，是准确、快速检测乳及乳制品中金黄色葡萄球菌的首选方法。唐吉思等人［20］利用牛乳中金黄色葡萄球菌毒素A 基因（SEA）的荧光反应定性定量检测，为快速检测牛乳中的金黄色葡萄球菌提供了新的技术手段，其最低检测浓度为49.5fg／μL，该方法具有较好的特异性和敏感性。同样也有试验利用金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc设计具有特异性的引物，建立牛乳中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及其产毒菌株的快速检测方法，与传统分类学方法得到的结果相比具有100%的准确度，并具有较高的特异性和敏感性。还有试验利用金黄色葡萄球菌16S～23SrRNA 的特异性序列设计并合成引物，建立一种可以直接从牛乳中检测金黄色葡萄球菌的PCR 快速检测方法，同时优化反应条件，其最低检测浓度为35ng／μL，并可在5h内完成样品的检测，特异性高达100%。除此之外，利用产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A 基因序列，分别设计2对特异性引物，建立了牛乳中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A 的双重PCR 检测方法，同时优化反应条件，试验结果与细菌分离培养法检出的阳性样本数基本保持一致，准确率达到90%以上。

4.6 生物传感器技术

一些生物传感器已在包括牛奶在内的人工污染的食物样本中得到金黄色葡萄球菌的免疫诊断应用。这项技术使用抗体标记分子的方法，通过探测产生的信号发挥作用。双抗体夹心法是利用酶联免疫传感器来检测和量化用过氧化氢酶进行金黄色葡萄球菌抗A 蛋白抗体的标记。用于检测的样品由细菌培养及人工污染的食物组成，包括牛肉和牛奶。通过测量O2含量进行了检测和定量。虽然这种技术具有敏感性，但是为每个样品的电气检测较为缓慢而且技术上有困难。此外，在含量测定上采用膜上包被抗体的方法，在玻璃容器中阻碍了自动化的进程。这些类型的检测方法均缩短了获得结果的时间并倾向于自动化过程，但是相关成本和精密仪器的使用成为这一方法的主要困难。

4.7 生物芯片技术

生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。20 世纪90年代初期，利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、生化分析过程实现连续化、集成化、微型化的一种全新的微量分析技术，其效率是传统检测手段的成百上千倍［21］。

韩旭等［22］全面综述了PCR 方法、基因芯片和环介导等温扩增技术在奶牛乳房炎主要病原菌诊断中的应用。邢会杰等建立了奶牛乳房炎无乳链球菌、停乳链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌5种主要致病菌的基因芯片检测方法，结果显示芯片检测特异性高，检测的灵敏度为103CFU／mL。特异性生物芯片技术作为一种新型的生物技术，是一个学科交叉性很强的研究领域，其巨大的潜力和诱人的商业前景是有目共睹的，但由于目前的一些技术难点还没有完全攻破［23］，从而限制了市场的需求。

5 小结

综上所述，一种具有速度快、灵敏度高、成本低和操作简便的优良特性的兽医临床诊断方法，是现如今疾病诊断的发展方向。随着各类诊断方法的发展，已从血清学诊断方法到了免疫学诊断方法的新时代，具有兽医临床意义的疾病诊断方法在商品化时代有了新的进展。与此同时，作为细菌培养的替代方法，一些免疫学诊断方法不仅能够直接鉴定葡萄球菌性乳房炎的致病菌，而且可以用于金黄色葡萄球菌所引起的乳房炎的检测。但是，这类检测技术需要具有一定基础仪器设施的实验室和一定操作技能的实验员，在实际生产推广过程中还需解决一些问题。然而，通过培训一些技术人员或畜牧场主，让他们基本掌握这类技术，提前做好预防或及时治疗，可以大大降低这类疾病带来的经济损失，还能反馈大量临床试验数据，更好地为改良这类技术打下基础。还有报道称，可以利用免疫学方法检测隐性乳房炎，但是还需实际临床推广才能验证。

目前为止，已有一些研究利用金黄色葡萄球菌表面蛋白原核表达的特异性，作为免疫检测靶标建立相应免疫学诊断方法［24］。另外，一些研究表明，利用噬菌体改变微生态平衡条件，可以解决细菌耐药性的问题，进而改善甚至彻底摆脱这类疾病的困扰［25］。而且，金黄色葡萄球菌A 蛋白的生物标记物也是近些年来的研究热点。总之，利用免疫学原理结合我国畜牧业生产实际需求，这类诊断方法用于各类疾病诊断的研究还有很大上升空间，而且通过在临床诊断的应用还能够不断完善基层兽医领域的建设，为我国疾病防控提供可靠的依据。

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