史应学, 王　迪, 竺俊全 , 吴雄飞

(1. 宁波大学 教育部应用海洋生物技术重点实验室, 宁波 315211;2. 宁波市海洋与渔业研究院, 宁波 315012)

中国花鲈精子超低温冷冻前后的活力及酶活性比较

史应学1, 王迪1, 竺俊全1, 吴雄飞2

(1. 宁波大学 教育部应用海洋生物技术重点实验室, 宁波 315211;2. 宁波市海洋与渔业研究院, 宁波 315012)

以Cortland液为稀释液、10%EG为抗冻剂、0.25 mL麦细管为冻存管，两步降温法超低温冷冻中国花鲈精子，对冷冻前后精子活力及6种酶活性变化进行了测定。结果表明，冻存15 d与30 d的冻精激活率及运动时间分别为(86.67±3.79)%及(15.08±0.72)min、(86.00±3.61)%及(14.83±1.23)min，与鲜精激活率(92.67±2.52)%及运动时间(15.75±1.25)min相比无显著差异。冻存15 d与30 d的冻精总ATP 酶、SDH、LDH、SOD、CAT和GR活性分别为：(73.09±3.94)U/mL与(71.57±5.51)U/mL、(44.67±4.93)U/mL与(43.67±4.93)U/mL、(6916.93±265.45)U/L与(6889.73±262.63)U/L、(84.80±4.08)U/mL与(84.42±3.09)U/mL、(92.37±7.64)U/mL与(92.13±7.37)U/mL、(79.01±3.93)U/L与(75.91±2.95)U/L，与鲜精酶活性相比差异不显著。认为以Cortland液为稀释液、10%EG为抗冻剂、两步降温法超低温冷冻中国花鲈精子的效果较好。

中国花鲈; 精子; 活力; 超低温冷冻; 酶活性

中国花鲈(Lateolabraxmaculatus)又名鲈鱼，属鲈形目、鮨科、花鲈属，为中国沿海重要经济鱼类及增养殖种之一，也是出口创汇水产品种。由于历年过度捕捞及环境污染等因素，其自然资源衰退，养殖品种也因近亲繁殖出现种质退化现象。精子超低温冷冻保存是种质保存的有效措施之一，在育种及育苗生产上具有实际应用价值。以往，有关中国花鲈精子的超低温冷冻保存研究已见报道，主要涉及抗冻液、稀释比、冷冻及解冻方法等方面[1-2]，尚未见超低温冷冻对中国花鲈精子酶活性影响方面的研究报道。精子酶活性，如ATP酶、SDH(琥珀酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)及SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、GR(谷胱甘肽还原酶)活性与精子活力密切相关[3-8]；超低温冷冻、解冻过程对精子造成的机械损伤及膜蛋白从细胞膜中分离所造成的细胞膜肿胀、畸形及翻转等变化，导致酶类物质溢出[9]；对冷冻精子的酶活性进行检测，可为精子质量的评价提供依据[8-16]。本研究以Cortland液为稀释液、10%EG为抗冻剂、0.25 mL麦细管为冻存管，两步降温法超低温冷冻中国花鲈精子，对冷冻前后精子活力及6种酶活性变化进行了测定分析，旨在补充中国花鲈精子超低温冷冻保存技术资料。

1　材料和方法

1.1材料

性成熟中国花鲈雄鱼于2013年11月23日取自浙江省奉化市石沿育苗厂，鱼体重3.0～4.0 kg/尾，共10尾，经促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素(LRH-A +HCG)催产，暂养于水温为14℃～15℃的水泥池中，30 h后采精。

1.2方法

1.2.1精液的采集用鱼夹夹住鱼，用干毛巾擦去生殖孔周围及体表的水分，轻压鱼腹使精液自然流出，用洁净的注射器将精液移入离心管中，置于冰浴上(4℃)备用。

1.2.2精子的超低温冷冻及解冻 将精液稀释液即Cortland液(NaCl 7.25 g/L，NaHCO31.00 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.41 g/L，KCl 0.38 g/L，CaCl20.18 g/L，MgSO4·7H2O 0.23 g/L，C6H12O61.00 g/L，pH值为7.00)与10%EG(乙二醇，终浓度)混合配制成抗冻液，置于冰箱(4℃)预冷；将采得的精液与抗冻液按1∶3比例混匀，4℃平衡30 min；将平衡后的精液-抗冻液混合物分装入0.25 mL麦细管中，然后用两步降温法(即将盛精麦细管平放在自制简易降温装置的液氮面上7.5 cm处，停留10 min后投入液氮中)保存。超低温冷冻15 d和30 d后，将麦细管从液氮中快速取出，于40℃水浴中溶化后进行精子活力与酶活性检测。

1.2.3精子活力测定 以过滤海水(水温15℃、pH值8.1、盐度27)为激活液，将鲜精和冻精分别与激活液混合后在显微镜下观察精子活力(激活率、活动时间和寿命)。激活率为给定视野中被激活精子的数量占全部精子数量的百分比；运动时间是指精子自激活开始至90%的精子原地颤动为止所经历的时间；精子的寿命指精子从激活开始至90%的精子停止运动的时间。实验重复3次。

1.2.4酶活性检测方法按章龙珍等[8]的方法处理鲜精和冻精样本。用购自南京建成生物工程研究所的酶活检测试剂盒测定总ATP酶、SDH、LDH及SOD、CAT、GR活性，实验操作参照各说明书进行。实验重复3次。

1.2.5数据分析

采用SPSS17.0软件对实验数据进行处理，用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验各组酶活性、精子活力的差异显著性，差异显著水平为P<0.05。统计结果以平均值±标准差表示。

2　结果

2.1中国花鲈鲜精与冻精的活力

鲜精及超低温冷冻15 d和30 d后解冻的中国花鲈精子活力测定结果见表1。统计分析表明，鲜精与冻精的活力相比差异不显著。

表1 中国花鲈鲜精与冻精的活力

D0—鲜精; D1—冷冻15 d的冻精; D2—冷冻30 d的冻精; 表中同列数据上方标注的字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

2.2 中国花鲈鲜精与冻精的酶活性

图1 中国花鲈鲜精与冻精的总ATP酶活性

图2 中国花鲈鲜精与冻精的SDH活性

从图1可见，中国花鲈鲜精、超低温冷冻保存15 d及30 d后的冻精总ATP酶活性分别为(80.13±3.21)U/mL、(73.09±3.94)U/mL及(71.57±5.51)U/mL，三者之间无显著差异。

图3 中国花鲈鲜精与冻精的LDH活性

从图2可知，中国花鲈鲜精SDH活性为(52.00±2.65)U/mL，经超低温冷冻15 d后，SDH活性降为(44.67±4.93)U/mL，30 d后SDH活性降至(43.67±4.93)U/mL，三者之间无显著差异。

图4 中国花鲈鲜精与冻精的SOD活性

由图3可见，中国花鲈鲜精LDH活性为(7342.00±147.53)U/L，经超低温冷冻15 d后LDH活性降为(6916.93±265.45)U/L，30 d后降至(6889.73±262.63)U/L，三者之间差异不显著。

由图4可见，中国花鲈鲜精SOD活性为(90.42±2.83)U/mL，经超低温冷冻15 d后SOD活性降为(84.80±4.08)U/mL，30 d后降至(84.42±3.09)U/mL，三者之间无显著差异。

图5 中国花鲈鲜精与冻精的CAT活性

图6 中国花鲈鲜精与冻精的GR活性

由图5可知，中国花鲈鲜精内CAT活性为(108.74±11.37)U/mL，经超低温冷冻15 d后CAT活性降为(92.37±7.64)U/mL，30 d后降至(92.13±7.37)U/mL，三者之间无显著差异。

从图6可见，中国花鲈精子内GR活性随冷冻时间的延长，活性先上升而后下降。中国花鲈鲜精内GR活性为(73.82±3.37)U/L，经超低温冷冻15 d后，GR活性升到(79.01±3.93)U/L，30 d后GR活性为(75.91±2.95)U/L，三者之间差异不显著。

3　讨论

ATP酶通过催化ATP水解产生ADP及无机磷释放能量以维持生命体的各种生命活动，ATP含量受ATP酶活性影响。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上，其活性在一定程度上反映了精子线粒体的功能[11]。精子经超低温冷冻后，线粒体会出现脱落、移位及肿胀、膜破裂等损伤，这些损伤将导致SDH活性发生变化[9,17-18]。LDH是一种糖酵解酶，在体内能量代谢、精子发生及受精过程中起重要作用，精子的LDH活性可作为精液质量检测的指标[12]。有研究表明，ATP酶、SDH及LDH活性与精子活力相关[3-5]。黄晓荣等[14-15]对长鳍篮子鱼(Siganuscanaliculatus)精子和日本鳗鲡(Anguillajaponica)精子超低温冷冻后发现，精子总ATP酶、SDH活性显著下降、活力明显降低；闫秀明等[9]对黄鳝(Monopterusalbus)精子超低温冷冻后发现，精子LDH活性明显下降、活力显著降低。Babiak等[16]试验发现，虹鳟(Oncorhynchusmykiss)精子在超低温冷冻后LDH活性显著下降、活力明显受影响。本研究，超低温冷冻15 d、30 d的中国花鲈精子与鲜精相比，总ATP酶、SDH、LDH活性及精子活力未见明显变化。

精子在超低温冷冻过程中会产生大量的活性氧，活性氧是自由基的重要组成部分，过多的自由基如不能被及时清除，精子会遭受脂质过氧化等损伤，导致活力降低[6,8,19]。SOD是以自由基为底物的酶，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免遭损伤，对机体的氧化和抗氧化平衡起至关重要的作用；CAT又称为触酶，是生物防御体系的关键酶之一，可促使H2O2分解为水和氧，从而保护细胞免遭H2O2的损害；GR是一种黄素酶，可通过催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH )来维持细胞膜的完整性。有研究表明，SOD、CAT及GR活性与精子活力密切相关[6-8]。黄晓蓉等[14-15]发现，长鳍篮子鱼精子和日本鳗鲡精子在超低温冷冻后GR活性显著上升，SOD、CAT活性显著下降，精子活力明显降低；章龙珍等[8]发现，俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedti)精子在超低温冷冻后SOD、CAT、GR活性及精子活力也有相似变化。本研究，超低温冷冻15 d、30 d的中国花鲈精子与鲜精相比，SOD、CAT、GR活性及精子活力变化不明显。

在冷冻、解冻过程中，精子内冰晶的形成和消失及精子外渗透压改变引起的挤压作用，会对精子造成一定的机械损伤，同时，精子膜蛋白因从细胞结构中分离会导致细胞膜发生肿胀、畸形及翻转等变化[9,18]。各种损伤将导致酶类物质从精子内溢出，另外，低温冷冻对酶类物质的结构也会造成一定程度的损害，从而降低了精子的酶活性。但精子在冻存及解冻条件适宜的情况下，结构不易损伤，酶活性能得到较好保护。本研究中，超低温冷冻保存30 d内的中国花鲈精子能量代谢酶和抗氧化酶与鲜精相比差异不显著，说明精子冻存条件较适宜，酶活性保护较好。

一般认为，精子在超低温冷冻保存条件下处于休眠状态，保存时间长短对精子质量无显著影响[20]。Suquet等[21]研究发现，超低温冷冻保存9个月的大菱鲆(Psettamaxima)精子，受精率、活力与鲜精相比无显著差异；Ding等[22]研究发现，超低温冷冻保存1周和1年的鳜鱼(Sinipercachuatsi)精子，受精率、孵化率与鲜精相比差异不明显；陈亚坤等[20]研究发现，超低温冷冻保存1、13和26个月的真鲷(Pagrusmajor)精子，激活率和受精率没有显著变化，但在冷冻保存48个月，激活率和受精率则显著降低。本研究中，超低温冷冻30 d内的中国花鲈精子活力及6种酶活性没有显著变化。

综上所述，以Cortland液为稀释液、10%EG为抗冻剂、两步降温法超低温冷冻30 d内的中国花鲈精子，其内能量代谢酶和抗氧化酶受到了较好保护，精子活力较高。

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Motility and enzyme activities of fresh and cryopreservated sperm inLateolabraxmaculatus

SHI Ying-xue1, WANG Di1, ZHU Jun-quan1, WU Xiong-fei2

(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University,Ningbo 315211; 2. Ningbo Academy of Oceanology and Fisheries, Ningbo 315012, China)

In order to investigate damage mechanism of sperm after cryopreservation(-196℃), we used 10%EG(ethylene glycol) as cryoprotectant, Cortland as extender, and two-step cooling procedure to cryopreserveLateolabraxmaculatussperm in 0.25 mL straws. The motility of fresh sperm and frozen-thawed sperm was detected by microscopy and the enzyme activities by reagent kits. The results showed that there were no significant differences between fresh sperm and frozen-thawed sperm of freezing for 15 d or 30 d in motility. The activation rate, moving time and life-span of fresh sperm were (92.67±2.52)%, (15.75±1.25)min and (20.67±1.76)min, and (86.67±3.79)%, (15.08±0.72)min and (19.83±1.44)min of frozen-thawed sperm for freezing 15 d, and (86.00±3.61)%, (14.83±1.23)min and (19.67±0.52)min of freezing for 30 d. The activities of total ATPase, SDH, LDH, SOD, CAT and GR of frozen-thawed sperm after cryopreservation for 15 d and 30 were (73.09±3.94)U/mL, (44.67±4.93)U/mL, (6916.93±265.45)U/L, (84.80±4.08)U/mL, (92.37±7.64)U/mL, (79.01±3.93)U/L and (71.57±5.51)U/mL, (43.67±4.93)U/mL, (6889.73±262.63)U/L, (84.42±3.09)U/mL, (92.13±7.37)U/mL, (75.91±2.95)U/L, respectively. In addition to GR, the other enzyme activities all decreased with the freezing time prolonged. Enzyme activities detection showed that there was no significant difference between fresh sperm and frozen-thawed sperm inLateolabraxmaculatus. So we concluded that cryopreservation had no significant effects on the enzyme activities and motility of sperm inLateolabraxmaculatususing the previous procedure.

Lateolabraxmaculatus; sperm; motility; cryopreservation; enzyme activities

2015-01-14；

2015-02-11

宁波市科技计划重大项目(2015C110005);国家海洋局海洋药源生物种质资源库建设项目(12PYY001SF08-NBDX-1)；浙江省水产新品种选育专项(2012C12907-8)

史应学，硕士研究生，主要从事水产动物遗传育种研究，E-mail: ahsyxue@163.com；

竺俊全，教授，主要从事水产生物学研究，E-mail: zhujunquan@nbu.edu.cn。

S965.211；S917.4

A

2095-1736(2015)05-0048-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.048