(1. 云南师范大学生命科学学院 云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室 昆明 650500； 2. 大理州巍山县第二中学， 巍山 672401)

云南剑川地区大绒鼠线粒体细胞色素b和控制区遗传多样性的研究

沐 远1， 杨 涛1， 马壮琼2， 张 浩1， 朱万龙1， 王政昆1

(1. 云南师范大学生命科学学院 云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室 昆明 650500； 2. 大理州巍山县第二中学， 巍山 672401)

通过对云南剑川30个大绒鼠样本线粒体细胞色素b基因(Cytb)和控制区(D-loop)序列研究，初步探讨剑川大绒鼠的遗传多样性及系统发生。结果表明，剑川地区大绒鼠Cytb包含16个变异位点(占全序列的1.40%)，其中转换3个，颠换0个，核苷酸多样性(Pi)为0.00269，单倍型多态度(Hd)0.876±0.041，共定义12个单倍型。D-loop全长987 bp，包含28个变异位点(占全序列的2.84%)，其中转换5个，颠换1个，Pi为0.0055，Hd为0.924±0.029，共定义16个单倍型。Cytb和D-loop单倍型系统树显示，30个样本形成两支，且D-loop序列中显示出的多样性水平可推测其种群比Clethrionomys种群更年轻。其基因的多样性水平可能与其分布范围和生态因子有关。

生态学；大绒鼠；遗传多样性

绒鼠属(Rodentia, Cricetidae, Microtinae,Eothenomys)主要分布于中国的横断山及其附近地区[1]，属于田鼠亚科(Arvicolinae)动物。横断山地区位于南亚次大陆与欧亚大陆镶嵌交接带东翼，为中国环太平洋带与西部古地中海带间的过渡地带[2]。第四纪以来，由于冰川活动和云贵高原隆起，导致该地区气候特征由湿润、温暖向干燥、寒冷演化，且该地区气候年温差小，日温差大[3]。绒鼠化石在横断山发现至今，有关于该类物种大规模扩散和迁移的报道甚少[4]。对田鼠亚科动物研究有利于对第四纪原始气候和环境的了解[5]，此外，冰期与间冰期的多次交替出现，对物种多样性的产生造成了巨大的影响[6]。

动物线粒体DNA(mtDNA)分子小而稳定、母系遗传、进化速度快等特征，已成为进化生物学，保护生物学和遗传多样性分析研究的一个强有力的工具[7]。其分为非编码区和编码区两个部分，非编码区就是线粒体基因的控制区(即D-loop)，编码区编码包括tRNAs，rRNAs，疏水性蛋白质多态，细胞色素b(Cytb)，ATP酶的亚单位，细胞色素c(Cytc)，氧化酶的亚单位(COI、COII、COIII)，NADP还原酶复合体的亚单位等[8]。哺乳动物线粒体基因的进化速率远远高于单拷贝核基因，可达单拷贝基因的5～10倍，因此适合于做群体遗传学分析的分子标记[9]。为了进一步提供更多有关于绒鼠的群体遗传信息，本研究对云南剑川地区大绒鼠Cytb和D-loop的遗传多样性进行检测，为该地区大绒鼠乃至绒鼠属的分类及多样性提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用的30只大绒鼠(Eothenomysmiletus)均捕自云南省剑川石龙村(北纬25°25′～26°22′，东经102°13′～102°57′)附近的灌丛及农田(海拔1679 m)。

1.2 实验方法

1.2.1 mtDNA提取参见朱万龙等[10]。

1.2.2 引物设计及PCR 扩增

1)CytbPCR引物采用Irwin等报道的哺乳动物Cytb通用引物[11]。

PCR反应体系建立参见朱万龙等[10]。扩增循环设置如下：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃延伸7 min。

2)D-loopPCR引物根据谢建云等东方田鼠引物[12]，修改为：

KZ-F：5′-acttaaattactctggtcttgtaacct-3′

KZ-R：5′-ataaatttaaaggccaggaccaaaacc-3′

引物覆盖段基因长度为1 073 bp。

PCR反应体系建立参见朱万龙等[10]。扩增循环设置如下：94℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃延伸7 min。

1.2.3 PCR产物的纯化和测序

PCR 产物用0.8 %的琼脂糖电泳检测，在凝胶成像仪观察，割下亮带。将割下的胶用Glassmilk DNA 纯化回收试剂盒(博大泰克生物基因技术有限责任公司的产品)进行纯化回收，回收产物送大连宝生物工程有限公司测序(测序使用试剂：BigDye Terminatort v3.1 Cycle Sequencing Kit；测序仪器：ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer；ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer)。

1.2.4 数据分析

序列用Clustalx软件分析比对，用MEGA(version 3.10)中的Kimura双参数法计算各单倍型间的遗传距离。利用DNASP (version 4. 0)统计单倍型及变异位点、计算单倍型多样性(Hd)及核苷酸多样性(Pi)[13]。采用MEGA 3.1邻接法(Neighbor-joining method, NJ)、最小进化(Minimum Evolution, ME)和最简约法(Maximum Parsimony, MP)对30个样本中单倍型的样本构建系统树[14]。系统树各分支的自举检验值(Bootstrap)由1 000次重复检验。

图 1 NJ、ME和MP方法构建剑川地区绒鼠Cyt b单倍型系统发生树

每支上面的数字表示基于1 000 次重复的不同方法的自举检验置信度。下同。

2 结果

2.1Cytb核苷酸组成及多样性参数

30只绒鼠Cytb序列(1 140 bp)中，A、T、C和G的比例分别为29.8%、26.3%、30.6%和13.3%，A+T含量明显高于G+C含量。其中，共发现16个变异位点，占分析位点数的1.40%，包括3个转换(transition, Ts) (第1位点2个；第3位点1个)和0个颠换(transversion, Tv)位点，简约信息位点(parsimonious informative site)11个，占全序列的0.96%。

表1 12个单倍型个体Cyt b基因序列的Kimura双参数模型的遗传距离

多态位点数(S)为16，核苷酸多样性(Pi)为0.002 69，平均核苷酸差异数(K)为3.069。30条Cytb序列中，单倍型12个，单倍型多态度(Hd)为0.876，Hd标准误为0.041。对12个单倍型构建系统树，其中主要分为两支(图1)。Kimura双参数法(Kimura, 1980)计算的12个单倍型间的遗传距离在0.001～0.007(表1)。

2.2D-loop核苷酸组成及多样性参数

D-loop序列(1 073 bp)中，tRNA Pro与tRNA Phe之间所包含的D-loop序列长987 bp。987 bp中A、T、C和G的比例分别为29.7%、29.4%、27.4%和13.5%，A+T含量明显高于G+C含量，核苷酸偏向性较Cytb明显。28个变异位点(占分析位点数的2.84%)中包括5个转换(第1位点1个，第2位点和第3位点分别两个)和1个颠换位点(第3位点)，简约信息位点(parsimonious informative site)20个，占2.03%。Ts/Tv为9.4。

其中ETAS区有4个转换，没有颠换，Ts/Tv为15.5，18个变异位点，占分析位点数的7.11%；CSB区不存在转换和颠换，差异由缺失产生，1个简约信息位点，2个变异位点，占分析位点数的1.90%。Central区域中也没有转换和颠换，1个简约信息位点，1个变异位点，占分析位点数的3.1%。D-loop多态位点数S为28，Pi为0.0055，K为5.901。30条D-loop序列共检测到16个单倍型。Hd为0.924，Hd标准误0.029。对16个单倍型构建系统树，其中主要分为两支(图2)。16个单倍型个体间Kimura双参数法计算的遗传距离在0.001～ 0.015(表2)。

图 2 NJ、ME和MP方法构建剑川地区绒鼠D-loop单倍型系统发生树

D1D2D3D4D7D9D12D13D14D17D18D19D21D25D27D29D1D20．014D30．0030．011D40．0020．0140．003D70．0010．0130．0020．001D90．020．0140．0030．0020．001D120．0020．0140．0030．0020．0010．002D130．0090．0080．0070．0090．0080．0090．009D140．0040．0140．0050．0040．0030．0040．0040．011D170．0050．0130．0020．0030．0040．0050．0050．0070．007D180．0060．0120．0030．0060．0050．0060．0060．0080．0060．005D190．0090．0100．0070．0090．0080．0090．0090．0020．0110．0070．008D210．0040．0140．0050．0040．0030．0020．0040．0110．0060．0070．0080．011D250．0030．0150．0040．0030．0020．0030．0030．0100．0050．0060．0070．0100．005D270．0020．0120．0010．0020．0010．0020．0020．0080．0040．0030．0040．0080．0040．003D290．0020．0140．0030．0020．0010．0020．0020．0090．0040．0050．0060．0090．0040．0030．002

3 讨论

3.1Cytb多样性

mtDNA中Cytb基因是线粒体呼吸链上的一个亚单位，其进化速率适中，一个较小的基因片断就包含着种内到种间乃至科间遗传进化信息，常常被用作研究系统进化、种属间分类的分子标记[15]。剑川石龙30个大绒鼠的Cytb(1 140 bp)中，转换3个，没有颠换位点。哺乳动物的mtDNA碱基替换中存在转换偏倚性(Bias)，即随着进化时间增加，颠换会逐渐地积累，而转换偏倚性会下降[16]，因此我们认为此基因序列的突变仍未达到饱和状态，随着时间的推移，遗传差异的增加，转换将趋于饱和。对于Cytb而言，DNA水平上受自然选择压力的影响，密码子第3位点的突变率高于第1和第2位点。然而第3位点绝大多数是同义突变，受自然选择压力小远远小于第1、第2位点，突变后易被固定[17]。该地区绒鼠Cytb基因中3个转换两个发生在第一位点，一个发生在第3位点，因此自然选择可能对该物种压力较大。

核苷酸多样性(Pi)是检测遗传多样性的重要指标，Pi的高低与物种的适应能力、生存能力和进化潜力密切相关[18]。据Neigel报道，同种哺乳动物不同的个体之间平均核苷酸顺序歧异值都存在有较大的差异，一般在0.3%到4%之间，最大的竟达10%以上[19]。我们的研究表明，剑川地区大绒鼠Cytb的Pi与其它小型哺乳动物相比偏低(表3)，这可能是其迁移能力及分布较窄相关。

表3 不同物种mtDNACytb核苷酸多样性

Table 3 Nucleotide diversity at the mtDNACytbamong different species

物种Species种名Name核苷酸多样性Nucleotidediversity参考文献Reference大绒鼠E．miletus0．00269本研究荒漠伪鼠Pseudomysdesertor0．102～0．136Alpersetal．，2003[20]长爪沙鼠Merionesunguiculatus0．022～0．999梁 君等，2007[21]大沙鼠Rhombomysopimus0．00222～0．00665宁恕龙等，2007[22]中缅树鼩Tupaiabelangeri0．00455～0．00523朱万龙等，2014[10]高山姬鼠Apodemuschevrieri0．001741～0．006433朱万龙等，2013[23]高原属兔Ochotonacurzoniae0．0248葛艳丽等，2009[24]鼢鼠Eospalax0．08786杨红善等，2007[25]睡鼠Glisglis0．06Naderietal．，2014[26]

3.2D-loop多样性

D-loop为不编码基因，富含AT碱基，其DNA序列的进化速度在mtDNA中最快，是群体遗传研究中最佳的分子标记，适合做不同群体遗传变异的研究。剑川地区30只大绒鼠tRNA Pro与tRNA Phe间包含987 bp的D-loop序列。且基因结构与其它鼠类的D-loop一致[27]。D-loop的长度会因物种的不同而不同：如C.Rufocanus970～971 bp；C.Glareolus945～946 bp；C.Gapperi945～947 bp；C.Californicus943～944 bp；C.Rutilus942～944 bp[28]。该地区大绒鼠的D-loop长987 bp，明显的长于Clethrionomys。

987 bpD-loop中，A、T、C和G比例分别为29.7%、29.4%、27.4%和13.5%，A+T含量明显高于G+C含量，这与其它鼠类相似[29]。28个变异位点，占总位点的2.84%，明显高于Cytb，这主要由于D-loop富含AT碱基，因此比线粒体基因其它区域突变更高[30]。28个变异位点中，5个转换和1个颠换，Ts/Tv为9.4。在物种水平上，该区段会倾向于转换，如Rattus[29]和Clethrionomys[28]。ETAS区有4个转换，没有颠换，Ts/Tv为15.5，18个变异位点，占总位点的7.11%；CSB区域没有转换及颠换，存在的差异由缺失产生，变异位点2个，占总位点的1.90%。Central区域中没有转换和颠换，1个变异位点，占总位点的3.1%。该地区大绒鼠D-loop的基因突变，与Clethrionomys报道的相似[28]，但与Rattus不同[29]。

就目前的化石资料[31]、形态及染色体核型[32]而言，尚不能判定绒鼠和Clethrionomys的整个起源、进化及扩散。该地区大绒鼠Pi为0.0055，K为5.901。30条D-loop序列检测到16个单倍型，Hd为0.924±0.029。该地区大绒鼠D-loop的多样性少于Clethrionomys中的C.glareolus、C.gapperi和C.rutilus[28]。根据中性理论，在基因多样性水平上，较古老的物种将比年轻的物种具有更高的多样性，由此推测该地区大绒鼠比C.glareolus、C.gapperi和C.rutilus种群更年轻。此外，基因可变的分布不是随机发生的，它与物种生存的环境密切相关，可以解释物种对生态因子的适应结果。Reyes研究表明，鼹形鼠D-loop多样性的变化与其生存环境中干旱和温度的压力有重要关联[33]。第四纪以来，由于冰川活动和云贵高原提升，导致横断山地区气候特征发生剧烈变化[3]，因此在外界环境强烈干扰下，物种多样性乃至生物多样性也随之发生变化。在种群扩散过程中，多样性水平受到多种环境因子的影响，可能随着降雨和季节性的差异而发生变化[28]。因此，这也可能是导致剑川地区大绒鼠D-loop多样性少于Clethrionomys的原因之一。

总之，云南剑川地区大绒鼠Cytb和D-loop都显示出其多样性相对较小。从D-loop序列中显示出的多样性水平推测，该地区大绒鼠种群比Clethrionomys种群更年轻。此结果为进一步研究田鼠亚科动物(Eothenomys、Clethrionomys、Alticola以及Caryomys等各属间)的演化关系提供了一定的分子遗传学基础。该地区大绒鼠基因的多样性水平可能与其分布范围和所处生态因子有关。

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Genetic diversity of mitochondrial cytochromeband control region inEothenomysmiletusof Jianchuan, Yunnan Province

MU Yuan1, YANG Tao1, MA Zhuang-qiong2, ZHANG Hao1,ZHU Wan-long1, WANG Zheng-kun1

(1. Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-plants in Southwest Mountain Ecosystem of Yunnan Province Higher Institutes College, School of Life Sciences, Yunnan Normal University,Kunming 650500； 2. Weishan No.2 High School, Weishan, Dali 672401, China)

To investigate the genetic diversity of Orient voles (Eothenomysmiletus), DNA sequence variations in the mitochondrial cytochromebgene and control region of the 30 individuals from Jianchuan, Yunnan Province were measured. For cytochromebgene (Cytb), 16 nucleotide sites were variable (1.40% in the full sequences), including 3 transitions and 0 transversions among 1140 base pairs (bp), the nucleotide diversity (Pi) was 0.0296, the haplotypes diversity (Hd) was 0.876±0.041, and 12 haplotypes were identified in the 30 samples. For control region (D-loop), 987 base pairs were examined, 28 nucleotide sites were variable (2.84% in the full sequences), including 5 transitions and 1 transversions, the nucleotide diversity was 0.0055, the haplotypes diversity was 0.924±0.029, 16 haplotypes were identified in the 30 samples. Based on control region, the genetic diversity ofEothenomyswas less thanClethrionomys, so theEothenomyscould be younger thanClethrionomys, and the genetic diversity may be related with the distribution ranges and ecological factors.

ecology;Eothenomysmiletus; genetic diversity

2014-12-09；

2015-01-29

国家自然科学基金资助项目(No.31260097)；云南省应用基础研究项目(No.2013FA014)

沐 远，硕士在读，研究方向：动物生理生态，E-mail: islam19891001@163.com；

朱万龙，副教授，研究方向为动物生理生态，E-mail: zwl_8307@163.com；王政昆，教授，研究方向为动物生理生态，E-mail: wzk_930@126.com。

Q953

A

2095-1736(2015)05-0030-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.030