李 夫， 夏鹏飞， 戴雪辰， 石 康， 熊 鹰， 刘映乐

(武汉大学 生命科学学院 病毒学国家重点实验室， 武汉 430072)

人源FCHo1蛋白μHD结构域的表达、纯化及晶体生长

李 夫， 夏鹏飞， 戴雪辰， 石 康， 熊 鹰， 刘映乐

(武汉大学 生命科学学院 病毒学国家重点实验室， 武汉 430072)

人FCHo1 蛋白(Fer/Cip4 homology domain only proteins 1)是网格蛋白介导的内吞途径中的成核剂，其碳端μHD结构域(AP2-μ homology domain)对于FCHo1在披网格蛋白小泡(clathrin-coated vesicle)形成过程中的正确定位非常重要。为揭示人FCHo1碳端μHD结构域的作用机制，制备可衍射的μHD结构域蛋白质晶体并解析其结构至关重要。通过构建pET15b原核表达载体，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。利用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析技术，制备得到纯度95%以上的蛋白。通过多次优化结晶条件，获得衍射率约2.1 Å的μHD结构域蛋白晶体，为解析其晶体结构奠定了良好的基础。

FCHo1；μHD结构域；表达；纯化；结晶；衍射

网格蛋白(clathrin)介导的内吞作用是目前研究得较为清楚的内吞途径之一，也是大多数细胞内吞作用的主要途径[1]。网格蛋白介导的内吞途径在神经介质传递、信号传导、病原体入侵和细胞质膜活动等的调控中起重要作用，对于高等真核生物的正常生理活动十分必要[2]。网格蛋白主要通过包被细胞质膜形成披网格蛋白小泡发挥作用，最终将胞外大分子胞吞[3-4]。其中，包被小窝的形成主要依赖于FCHo1/2 (Fer/Cip4 homology domain only proteins 1 and 2)、Eps l5 (EGFR pathway substrate 15)和交叉蛋白-1 (intersectin-1)组成的蛋白复合体参与[5]。FCHo1蛋白是网格蛋白介导的内吞途径中的成核剂，对披网格蛋白小泡的成形和出芽极其重要，其表达水平的高低直接影响披网格蛋白小泡出芽，配体内吞以及支架蛋白的招募[6]，也能辅助BMP(bone morphogenetic protein)受体在原肠胚的形成过程中发挥功能[7]。人源FCHo1蛋白碳端μHD结构域(图1)在酵母和人中的功能是保守的，其与适配/支架蛋白(Ede1/eps15)的相互作用对于FCHo1蛋白在内吞途径中的正确定位至关重要[8-9]。同时，μHD结构域能与Dab2、Intersectin、Hrb等多种蛋白相互作用，和衔接蛋白AP2(adapter protein 2)附属物结构域一样[10-11]，形成网格蛋白介导的内吞途径的互作中心[12]。目前，关于FCHo1蛋白μHD结构域的结构尚不清楚，其发挥功能的具体机制仍需更深入的研究。X射线衍射仍是当今最为有效的蛋白质结构解析技术之一，本研究通过构建人源FCHo1蛋白碳端μHD结构域原核表达系统，经表达、纯化得到高纯度蛋白，并筛选出蛋白晶体，通过多次优化结晶条件，收集衍射率约2.1 Å的衍射数据，为解析μHD结构域晶体结构和揭示其结构与功能的关系奠定基础。

图1 人FCHo1蛋白结构域示意图[6]

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株BL21(DE3)和表达载体pET15b(Novagen)。PCR引物由北京天一辉远公司合成，基因测序由北京擎科新业公司完成。限制性内切酶、T4连接酶购自Thermo公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京康为世纪公司，DNA Marker 购自全式金公司，Pfu聚合酶为实验室制备。Ni-NTA Agarose为QIAGEN公司产品；阴离子交换柱Source 15Q，分子筛Superdex-200 10/30和蛋白纯化系统AKTA均为GE Healthcare公司产品。晶体筛选试剂盒购自Hampton Research 公司，化学试剂购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1μHD产物扩增及表达质粒构建

根据美国生物技术信息中心(NCBI)数据库NP_001154829.1：合成人源FCHo1蛋白碳端cDNA基因序列。设计μHD(622-891)上游扩增引物：5′-CGCATATGAGCCAAGATGCGTTACCGATTGCGACCG-3′(含NdeⅠ酶切位点)。由于Cys侧链巯基易氧化，因此将第889位Cys突变成Ser以降低蛋白被氧化程度，增加蛋白质的均一性，设计下游扩增/突变引物：5′-GCCCTCGAGTTACCAGGTGCTGCCTTGCGG-3′(含XhoⅠ酶切位点)。采用高保真Pfu DNA聚合酶PCR扩增目的基因片段，T4连接酶连接NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后的片段和载体，18℃，2 h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态中，涂于1 mmol/L氨苄抗性的LB平板，菌液PCR筛选阳性单克隆，提取质粒进行DNA测序。

1.2.2 μHD重组蛋白原核表达

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至10 mL 1 mmol /L氨苄抗性的LB培养基，37℃过夜培养。将过夜培养的细菌按1∶100比例接入1L LB液体培养基，37℃振荡培养，待菌液D600 nm光密度值为0.8～1.0，加入终浓度为0.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，降温至16℃，诱导过夜。

1.2.3 μHD重组蛋白纯化

离心收集菌体，用裂解缓冲液(pH值8.0)重悬，高压破碎细胞。将细胞破碎物4℃，14 000 r/min离心45 min，取上清转移至镍柱，经镍柱亲和层析和离子交换层析后，取离子交换图谱出峰位置对应管号的蛋白洗脱样品，SDS-PAGE电泳检测其大小和纯度。收集目的蛋白，并使用限制性蛋白酶切His标签。将切除标签后的蛋白浓缩，上样至分子筛层析柱进一步纯化，280 nm紫外波长检测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳检测分子筛蛋白洗脱样品浓度和纯度，将浓度和纯度均达到结晶要求的对应管号蛋白浓缩，分装，液氮速冻，-80℃保存。

1.2.4 μHD晶体生长条件初筛和优化

采用坐滴气相扩散法在18℃进行晶体生长条件初筛。使用Hampton公司的Index，Crystal Screen，SaltRx和PEG/Ion 4种试剂盒，蛋白与试剂按1∶1比例混合。根据初筛出晶条件，采用悬滴气相扩散法优化结晶条件。

2 结果

2.1μHD原核表达质粒构建

表达载体pET15b N端带有6×His标签序列，标签与外源片段之间含限制性蛋白酶切位点，用于切除蛋白标签。双酶切后的载体与外源片段使用T4连接酶连接。使用菌液PCR筛选μHD重组质粒阳性单克隆，目的条带大小与阳性对照大小一致(图2)，经测序和比对正确，成功构建μHD原核表达质粒。

2.2 μHD重组蛋白表达及镍柱亲和层析纯化

重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，16℃，0.2 mmol/L IPTG过夜诱导。SDS-PAGE电泳结果显示，目的蛋白大量表达，洗脱液样品泳道约33.5 ku处出现明显条带，与带标签的目的蛋白分子量大小符合(图3)。目的蛋白带有His标签，能紧密结合镍柱，而不带His标签的杂蛋白不结合或只能微弱结合。咪唑基团与目的蛋白竞争性结合镍离子。经多次优化，使用15 mmol/L浓度咪唑洗涤液能除去大量杂蛋白的同时尽量保留目的蛋白，可用含250 mmol/L高浓度咪唑的洗脱缓冲液将目的蛋白从镍柱上洗脱。

图2 μHD重组质粒菌液PCR鉴定

泳道1—μHD重组表达质粒菌液PCR条带；泳道2—阳性对照；泳道3—阴性对照；泳道M—DNA marker。

图3 μHD重组蛋白SDS-PAGE电泳检测

泳道M—蛋白marker；泳道1—菌体破碎后的沉淀；泳道2—菌体破碎后的上清；泳道3—镍柱上样流穿液；泳道4—含15 mmol/L咪唑杂蛋白洗涤缓冲液经镍柱后的洗脱液；泳道5—含250 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

2.3 离子交换和分子筛层析纯化

利用蛋白质带电性质差异，使用离子交换层析对蛋白进一步纯化。将从镍柱洗脱下的目的蛋白上样至Source 15Q阴离子交换柱。目的蛋白在电导率为13.4 mS/cm处呈现较高的单峰，其他杂蛋白不结合柱子或在其他电导率范围被洗脱(图4A)。SDS-PAGE电泳检测，收集出峰位置对应管号的蛋白切除标签，浓缩。使用分子筛Superdex-200 10/30进一步纯化目的蛋白。分子筛结果显示，出峰位置对应样品分子量大小与目的蛋白一致，紫外吸收峰值高，峰型对称且无拖尾现象，说明蛋白样品浓度高且性质均一(图4B)。收集出峰位置对应管号蛋白，SDS-PAGE电泳检测纯度达到95%以上。

图4 μHD重组蛋白离子交换(A)和分子筛(B)层析纯化

2.4 μHD晶体生长条件初筛、优化及衍射

蛋白与试剂按1∶1比例混合，18℃长晶体，2 d后观察细小晶体长出(图5A)。对结晶缓冲液pH值和沉淀剂浓度等进行多次优化，发现0.1 mol/L 柠檬酸，0.1 mol/L Bis-Tris-丙烷，pH值4.0，5%(w/v)聚乙二醇3350为晶体适宜生长条件，该条件下长出的晶体为体积较大的长棍形晶体(图5B)。优化的蛋白晶体同步辐射光源衍射分辨率达到约2.1 Å(图5C)，并收集一套完整数据。

图5初筛(A)和优化后(B)的μHD蛋白晶体及其衍射图(C)

3 讨论

已知与人FCHo1蛋白同源的酵母Syp1蛋白μHD结构域的晶体结构已解。目前，尚无人源FCHo1蛋白碳端μHD结构域的晶体结构。为解析人源μHD结构域晶体结构，进一步了解其作用机制，制备高分辨率的蛋白晶体非常重要。

人源μHD长849 bp，编码283个氨基酸，预测等电点为6.6，相对分子质量约为30.6 ku。针对μHD结构域蛋白难于结晶的问题，我们设计了一系列μHD蛋白截短体均未能获得可溶性蛋白或晶体，仅622～891截短体不影响蛋白可溶性表达且能结晶，说明其氮端前13个氨基酸会影响晶体的形成。μHD(622～891)蛋白含3个Cys，由于Cys侧链巯基易氧化，导致蛋白性质不均一，因此分别将第647、761和889位Cys突变成Ser，发现647和761位Cys突变后蛋白出现不溶，说明647和761位的Cys对其正确折叠是必需的。因此，仅将第889位Cys氨基酸突变为Ser，使蛋白性质更加均一。目的蛋白N端连接6×His标签，便于利用镍柱亲和层析纯化，提高了纯化效率，再经后续离子交换和分子筛层析纯化，蛋白纯度达到95%以上。

本研究通过构建μHD原核表达质粒并表达，经亲和层析、离子交换和分子筛层析，获得了浓度、纯度和均一性均达到结晶要求的FCHo1 μHD结构域蛋白，并筛选出晶体。多次优化结晶条件后，获得分辨率约2.1 Å的高分辨率蛋白晶体，为解析人源FCHo1 μHD结构域的晶体结构，进一步了解其结构与功能的关系奠定了良好的基础。

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Expression, purification and crystallization ofHumanFCHo1 μHD domain

LI Fu, XIA Peng-fei, DAI Xue-chen, SHI Kang, XIONG Ying, LIU Ying-le

(State Key Laboratory of Virology, College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China)

The human FCHo1 protein (Fer/Cip4 homology domain only proteins 1) is nucleator of clathrin-mediated endocytosis and its C terminal μHD domain (AP2-μ homology domain) is critical to the correct positioning of FCHo1 in the formation of clathrin-coated vesicles of clathrin-mediated endocytosis. To determine the crystal structure and understand the structural mechanism of human FCHo1 μHD domain，it is essential to obtain high resolution protein crystal which can be analyzed by X-Ray. The human FCHo1μHDwas cloned into the expression vector pET15b and verified by bacteria liquid PCR and gene sequencing. Proteins were overexpressed inE.coliBL21 (DE3) which induced by 0.2 mmol/L IPTG at 16℃ overnight. The recombined proteins were purified by Ni-affinity chromatography (Ni-NTA), ion exchange chromatography (IEC) and size exclusion chromatography (SEC), respectively. Proteins were detected by SDS-PAGE and the purity was over 95%. Crystal screen kits from Hampton Research were applied to the preliminary screening of μHD protein by setting-drop method. The human FCHo1 μHD protein crystal at about 2.1 Å resolution was acquired after optimizing the condition of crystallization by hanging-drop vapor-diffusion method and data were collected in Shanghai synchrotron radiation facility (SSRF). This study has built a good foundation for determining the crystal structure of human FCHo1 μHD domain.

FCHo1; μHD domain; expression; purification; crystallization; diffraction

2015-02-03；

2015-02-15

国家“973计划”项目(No. 2011CB504900)

李 夫，硕士研究生，专业方向为分子病毒学；

刘映乐，副教授，主要研究方向为分子病毒学，E-mail：mvlwu@whu.edu.cn。

Q786

A

2095-1736(2015)05-0007-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.007