西安市中心医院内分泌科(西安710003)

王丽萍

萝卜硫素对分化型甲状腺癌细胞NIS基因表达及摄碘能力的影响

西安市中心医院内分泌科(西安710003)

王丽萍

目的：研究萝卜硫素对分化型甲状腺癌细胞NIS基因表达及摄碘能力的影响。方法：选择乳头状甲状腺癌细胞系K1及滤泡状甲状腺癌细胞系FTC133进行体外培养，给予不同浓度萝卜硫素处理24h，通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测钠/碘同向转运体(NIS) mRNA的表达；通过γ计数仪检测甲状腺癌细胞摄碘能力。结果：反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果表明，萝卜硫素可以上调NIS基因的表达，并呈浓度依赖性；γ计数仪检测结果表明，萝卜硫素可以提高分化型甲状腺癌的摄碘能力。 结论：萝卜硫素为放射性碘治疗分化型甲状腺癌提供了新的思路。

在甲状腺癌的临床治疗中，化疗药物对其不敏感，而对于分化型甲状腺癌，放射性碘治疗疗效确切。因此，如何提高分化型甲状腺癌细胞的摄碘率成为研究热点。钠/碘同向转运体(Sodium/Iodide Symporter，NIS) 是一种跨膜糖蛋白，主要位于甲状腺滤泡细胞的基底膜上，是甲状腺滤泡细胞摄碘的分子基础。本研究以人分化型甲状腺癌细胞系K1、FTC133为研究对象，了解萝卜硫素对分化型甲状腺癌细胞NIS基因表达及摄碘率的影响。

材料和方法

1 材 料

1.1 细胞株：人甲状腺癌细胞系FTC133, K1由中国医科大学第一附属医院提供。

1.2 试剂：胎牛血清(FBS)：购自HyClone, Lot: NWCO389。非必需氨基酸：购自Gibco, Lot:1171639。丙酮酸钠：购自Gibco, Lot:1228076。中性蛋白酶：Gibco分装。D-MEM/F-12，RPMI Medium 1640：均购自Gibco, Lot:1294292、1250959。使用前每500 ml D-MEM/F-12培养基分别加入10%的FBS；每500 ml RPMI Medium 1640培养基分别加入10%的FBS，5 ml非必需氨基酸，5 ml丙酮酸钠，配置成完全培养基，过滤除菌，4℃保存。0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液：购自Gibco, Lot:1123262。二甲亚砜(DMSO)：购自MP Biomedicals，Lot:M4300，常温避光保存。萝卜硫素(L-Sulforaphane)：购自Cayman。

1.3 仪器：CO2细胞孵育箱(购自Thermo Scientific)，倒置显微镜XD-202(购自江南光学仪器厂)，CFX96荧光定量PCR仪(购自美国Biorad公司)，γ计数仪(购自上海上立检测仪器厂)。

2 方 法

2.1 细胞培养：取对数生长期的细胞，以3×105/ml密度接种于培养瓶中，24 h后待悬浮细胞贴壁，加入不同浓度萝卜硫素(5μM、10μM、20μM、40μM)，作用24 h后收集细胞进行相关指标的检测。

2.2 反转录实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)，RT-qPCR通过检测反应液中 SYBR Green I 的荧光强度，达到监控 PCR 产物扩增量的目的。SYBR®Green I与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR®Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。NIS上游引物序列为5'-CCTGCTAACGACTCCAGCA-3'，下游引物序列为5'-CCAGGGCACCGTAATAGAGA-3'，18s作为内参，上游引物序列为5'-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3'，下游引物序列为5'-CTTTCGCTCTGGTCCGTCTT-3'。

2.3 计数仪检测细胞摄碘能力：萝卜硫素作用24 h后用小试管收集细胞，调整细胞数，使每管的细胞个数为5×105个。离心后弃上清，预冷PBS清洗2次。向每个试管加入l ml含125I的HBSS溶液(含37kBq125I)，置于37℃孵箱1 h，离心弃掉上清液，以HBSS洗2次，γ计数仪检测细胞摄碘水平。

结 果

1 RT-qPCR检测NIS mRNA 分别给予K1及FTC133细胞不同浓度的萝卜硫素处理24 h，结果显示，萝卜硫素可上调NIS mRNA水平，并且呈剂量依赖性(图1)。

图1 萝卜硫素对K1及FTC133细胞NIS mRNA表达的影响(***P<0.001)

图2 萝卜硫素对K1及FTC133细胞摄碘率的影响

2 γ计数仪检测细胞摄碘能力 分别给予FTC133和K1细胞不同浓度萝卜硫素处理24h，结果5μM，10μM及20μM萝卜硫素对K1 细胞的摄碘率无明显作用，40μM萝卜硫素可明显提高K1细胞系摄碘率(P<0.001)；而10μM萝卜硫素即可提高FTC133细胞摄碘率，且随浓度的增加而增加(图2)。

讨 论

分化型甲状腺癌(DTC)占甲状腺癌的90%左右，大多数分化型甲状腺癌患者，经手术、放射性碘以及甲状腺素制剂替代治疗后预后良好。钠/碘同向转运体(NIS)是一种糖蛋白，位于甲状腺滤泡细胞基底膜上，可以将血液中的-I选择性、主动性地转运至滤泡上皮细胞中，-I 经过氧化物酶作用后，碘化甲状腺球蛋白(Thyrogloulin，Tg)上的酪氨酸残基，储存在腺泡腔内，通过溶酶体的作用，分解成甲状腺激素，以囊泡的形式释放到血液中， 调节全身的新陈代谢。DTC 浓聚131I的能力， 对其治疗有着非常重要的意义。131I治疗成为DTC术后处治的重要手段，但仍有约30%复发和转移，而且远处转移的患者，病灶对131I存在抵抗[1]。其原因是多方面的：有NIS基因突变、NIS mRNA减少、NIS蛋白表达异常、TSH受体突变、多次131I治疗后DTC细胞的退行性变，导致了摄碘功能的减低。Smit等[2]将hNIS基因转染入带有hNIS缺陷的滤泡性甲状腺癌细胞系FTCl33中，实验表明转染细胞对131I摄取增强。Shimura等[3]把rNIS的eDNA表达质粒转染丧失聚碘功能的鼠甲状腺细胞(FRTL-Tc)中，发现转染细胞(Tc-rNIS)在离体情况下具有聚碘能力。因此，如何提高摄碘率为放射性碘治疗分化型甲状腺癌提供了新的思路。

组蛋白氨基端赖氨酸残基的乙酰化可降低其与DNA的亲和力，从而影响组蛋白与DNA的结合。组蛋白脱乙酰化酶抑制剂[Histone-deacetylase(HDAC)inhibitors]可以在转录后水平增强NIS基因表达。体外实验研究发现对甲状腺癌细胞系给予一种HDAC抑制剂Triehostatin A(TSA)干预，肿瘤细胞NIS表达显著增加，得出结论TSA治疗与三种细胞系NIS表达增强存在直接关系[4]。萝卜硫素富含于十字花科植物，属于异硫氰酸盐类。有研究显示萝卜硫素可作为HDAC抑制剂发挥抗癌作用[5-6]。本实验中，给予不同浓度的萝卜硫素处理分化型甲状腺癌细胞系K1及FTC133，结果表明，萝卜硫素可上调NIS mRNA，并呈剂量依赖性，提高肿瘤细胞的摄碘率。若能够通过应用萝卜硫素的诱导分化作用，诱导NIS基因的表达，促进甲状腺癌细胞向成熟阶段分化，恢复或提高其摄碘能力，然后再结合放射性碘的联合治疗模式，则可能获得满意的临床效果。

本实验是建立在体外细胞培养的基础上得出的结论，缺少体内研究结果的证实。萝卜硫素作用的机制尚不清楚，是否是通过HDAC抑制剂发挥作用，还需进一步的实验证实。

[1] Dohán O1, De la Vieja A,Paroder V,etal. The sodium/iodide Symporter (NIS):Characterization, regulation, and medical significance[J].Endocr Rev,2003，24(1):48-77.

[2] 余永利，罗全勇，陈立波,等．分化型甲状腺癌术后131I治疗生存率分析[J]．中华医学杂志,2006,26(5):261-263.

[3] Smit J W，Shroder-Van D E J，Karperien M，etal．Reestablishment of in vitro and in vivo iodide uptake by transfection of the human sodium iodide symporter(hNIS)in a hNIS defectivehuman thyroid carcinoma cell line[J].Thyroid,2000,10(11):939-943．

[4] Zarnegar R，Brunaud L，Kananchi H，etal．Increasing the effectiveness of radioactive iodine therapy in the treatment of thyroid cancer using Trichostatin A，a histone deacety-lase inhibitor[J].Surgery,2002,132(6):984-990．

[5] Myzak MC, Hardin K, Wang R,etal. Sulforaphane inhibits histone deacetylase activity in BPH-1, LnCaP and PC-3 prostate epithelial cells[J]. Carcinogenesis ,2006,27:811-819.

[6] Pledgie-Tracy A, Sobolewski MD, Davidson NE. Sulforaphane induces cell type-specific apoptosisin human breast cancer cell lines[J]. Mol Cancer Ther, 2007,6:1013-1021.

(收稿：2015-03-02)

Effect of sulforaphane on sodium/iodide symporter gene expression and radioidide uptake of differentiated thyroid cancer cell line

The Department of Endocrinology, Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003)

Wang Liping

Objective: To study the effect of Sulforaphane on sodium/iodide symporter gene expression and radioidide uptake of differentiated thyroid cancer cell line. Method: the thyroid cancer cell line K1 and FTC133 were treated with different concentrations of sulforaphane for 24h,the expression level of NIS mRNA of K1 and FTC133 were determined by RT-qPCR and their radioiodide concentration activity were measured by γ-counter. Results: Sulforaphane can up-regulate the expression of NIS in a dose-dependent manner and also increase the ability of radioiodide concentration of differentiated thyroid cancer line. Conclusion:Sulforaphane provides a new idea for radioactive iodine treatment of differentiated thyroid cancer.

Thyroid neoplasms/therapy Thiocyanates Glycophorins Iodine radioisotopes Gene expression

甲状腺肿瘤/治疗 硫氰酸类 糖蛋白类 碘放射性同位素 基因表达

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.003