魏春，刘利峰，孔令民

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014）

毕赤酵母生产重组β-半乳糖苷酶的指数补料分批发酵研究

魏春，刘利峰，孔令民

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014）

对毕赤酵母重组表达源于植物乳杆菌的β-半乳糖苷酶的5 L罐高密度发酵进行了研究。建立了甲醇指数补料动力学模型，并考察了不同比生长速率对β-半乳糖苷酶生产的影响。四个不同比生长速率（0.010/h，0.029/h，0.043/h和0.058/h）的甲醇指数补料分批发酵结果表明，比生长速率对β-半乳糖苷酶生产具有显著的影响。最大β-半乳糖苷酶产量60 U/mL在比生长速率为0.029/h时获得。采用指数补料分批发酵工艺的β-半乳糖苷酶产量优于常规策略下的产量，该工艺在甲醇诱导后期具有明显生产优势。

毕赤酵母；β-半乳糖苷酶；指数补料；比生长速率

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23），又称乳糖酶，能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，可用于解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题。另外，某些种类的β-半乳糖苷酶还兼具转半乳糖基作用，在合成半乳糖苷化合物，比如功能性低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）等产品方面具有重要应用价值［1］。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶的酶学特性具有不同特点，适用于不同场合，因此寻求新的高效的β-半乳糖苷酶的研究仍是热点。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum WZ011）作为益生菌，其β-半乳糖苷酶具有良好的应用潜力［2］。毕赤酵母分泌表达具有杂蛋白少、高表达量等优点［3］。因此，在毕赤酵母中表达生产植物乳杆菌来源的β-半乳糖苷酶并加以发酵优化，将是实现该酶大量生产的有效手段。因此，对已构建的分泌表达重组β-半乳糖苷酶的毕赤酵母的补料发酵工艺进行了研究。指数补料是高密度发酵中的一种补料策略，也适用于研究微生物生理状态与产物之间的关系［4］。本文建立了一套能应用于发酵罐上生产β-半乳糖苷酶的毕赤酵母指数补料工艺，研究了诱导阶段比生长速率对产酶的影响，并与常规补料工艺进行了比较。

1 材料与方法

1.1 菌种

毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115用作重组表达的宿主（Invitrogen公司）。源于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum WZ011）的β-半乳糖苷酶基因被整合到毕赤酵母细胞分泌表达载体pPIC9k，然后转化宿主菌GS115获得Mut+型的重组表达菌株。

1.2 培养基

种子培养基（1 L）：YNB（Yeast nitrogen base withoutamino acids，Sigma公司）13.4 g，甘油10 g，生物素0.4 mg；发酵用BSM培养基（1 L）：甘油40 g，85%H3PO426.7 mL，CaSO40.93 g，K2SO418.2 g，MgSO4·7H2O 14.9 g，KOH 4.13 g，ANTIFOAM 204（Sigma）0.3 mL，PTM1 4.5 mL。

PTM1微量元素溶液的组成（1 L）：CuSO4· 5H2O 6.0 g，NaI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO4· 2H2O 0.2 g，HBO30.02 g，CoCl2·6H2O 0.914 g，ZnCl220.0 g，FeSO4·7H2O 65.0 g，生物素0.2 g，H2SO45.0mL，无菌过滤，4℃避光保存。

甘油补料培养基：50%（W/V）甘油（含12mL/ L PTM1）；甲醇补料培养基：含有12 mL/L PTM1的甲醇。

1.3 发酵

毕赤酵母细胞在种子培养基里生长至OD600为6时，以10%的接种量接种到装有3 L BSM培养基的5 L发酵罐中开始分批培养。用28%的氨水控制pH在5.0，温度控制在30℃，溶氧（DO）控制在空气饱和的40%，必要时补充纯氧。一旦DO迅速回升，表示培养基里的甘油完全消耗，分批培养结束，开始以15 mL/（L·h）的流速补料50%（W/ V）的甘油。3.5 h后停止甘油补料，先加入6 mL甲醇以便酵母快速适应甲醇，1.5 h后以2.5 mL/ (L·h)的流速补料甲醇2 h，然后按常规补料策略（Invitrogen公司毕赤酵母发酵指南）和指数补料策略流加甲醇进行诱导生产。

1.4 分析方法

1.4.1 细胞湿重（WCW）测定

积极开展水土保持知识进校园活动，针对中小学生开展了新一轮水土保持知识教育活动。在西宁市教委的支持下，2013年4月19日西宁市黄河路小学组织200余名师生在长岭水土保持科技示范园区开展了“携手保护生态，共建绿色家园”的主题活动。5月31日西宁市南川西路小学近1400名少年儿童到西宁长岭水土保持科技示范园开展水土保持科普教育户外实践活动。同时编印了中小学《水土保持科普教育知识读本》，在西宁市、海东市、黄南州等地中小学发放5000余册。面向生产建设单位、水土保持重点地区印发了《水土保持科普读本》1000余册。同时制作了《青海小流域综合治理纪实》《生态公园、绿色长岭》等两部专题宣传片。

取1 mL发酵液，以8 000 r/min离心5 min，去上清，称量菌体湿重（WCW）。取至少3次测定的平均值。

1.4.2 β-半乳糖苷酶酶活的测定

β-半乳糖苷酶酶活单位定义为：30℃每分钟水解1μmol ONPG的酶量定义为1 U。参照Invitrogen公司“Pichia Expression Kit”中的方法测定酶活。

2 结果与讨论

2.1 甲醇指数补料动力学模型的建立

为了实现指数补料策略在β-半乳糖苷酶发酵上的应用，需要建立相应的指数补料模型。由物料平衡可知，在毕赤酵母发酵的甲醇诱导阶段，甲醇比消耗速率vMg/（gWCW·h）满足以下关系［5］：

其中，μM是菌体以甲醇为碳源的比生长速率（1/h），YX/M是菌体关于甲醇的得率（gWCW/g），YX/M，M是菌体关于甲醇的最大得率（gWCW/g），m是菌体以甲醇为碳源的维持系数g/（gWCW·h）。YX/M，M和m可认为恒定，但是很难直接得到其数值，而vM和μM可以由发酵数据直接计算出。因此通过先前多批发酵得到多组vM和μM的数据，回归出两者之间的线性关系，由所得直线的斜率和截距就可得到YX/M，M和m，结果见图1。

图1 甲醇比消耗速率与比生长速率的关系

图1表明，甲醇比消耗速率与比生长速率呈线性关系(R2=0.977)，因此得下述方程：

在甲醇限制性补料、底物浓度维持不变的稳态条件下，由物料平衡可得下述方程［6-7］：

其中，FM，t（L/h）为甲醇补料速率，Xt（g/L）和Vt（L）分别为甲醇流加时间t时的湿细胞密度和发酵液体积，S为发酵液中的残留甲醇浓度（g/L），Si为补料液中的甲醇浓度（790 g/L）。由于甲醇为限制性流加，发酵液中残留甲醇很少，所以S相对于Si可视为S≈0，因此可得：

把FM，t（L/h）转换为以mL/h为流量单位的FM，可得到：

当酵母细胞在甲醇中生长的比生长速率恒定为μM时，菌体生长满足以下关系：

其中，X0（g/L）和V0（L）分别为指数补料开始时（这时的t设为0）的湿细胞密度和发酵液体积。把式（7）代入式（6）可得到以时间为变量的甲醇指数补料动力学模型：

2.2 比生长速率对β-半乳糖苷酶生产的影响

设定4个不同的比生长速率0.015/h，0.035/ h，0.05/h，0.065/h，应用方程（8）进行指数补料。甲醇诱导3.5 h后，开始指数补料甲醇，酵母生长能保持较恒定的比生长速率。由于系统误差，实际得到的比生长速率比设定的要小，分别为0.010/h，0.029/h，0.043/h，0.058/h。

图2 比生长速率对β-半乳糖苷酶产量的影响

图2表明，在甲醇诱导阶段，4个不同比生长速率对应的β-半乳糖苷酶产量也不同。当比生长速率维持在相对较低的0.01/h时，β-半乳糖苷酶产量为20 U/m L，也相对较低；当比生长速率在相对较高的0.043/h、0.058/h时，β-半乳糖苷酶产量在40 U/mL。当比生长速率维持在0.029/h时，β-半乳糖苷酶产量达最大。过高或过低的比生长速率均不利于β-半乳糖苷酶的生产。甲醇诱导阶段的比生长速率是影响毕赤酵母生产重组蛋白的最重要因素［8-9］。对于毕赤酵母分泌型表达，比生长速率甚至还能影响重组蛋白的糖基化程度［10］。文献报道的重组毕赤酵母在甲醇诱导阶段的最优比生长速率一般在0.018/h到0.035/h之间，具体数值和重组蛋白特性有关。比生长速率影响重组蛋白产量的机理可能是它影响生长和蛋白生产之间的能量平衡状态［11］。

2.3 常规补料策略与指数补料策略的比较

图3是按照常规的甲醇补料策略实施的发酵过程曲线，图4是诱导阶段实际维持0.029/h比生长速率的发酵过程曲线，在甘油分批培养阶段和甘油补料阶段采用相同工艺。酵母经过10 h左右的延滞期后进入快速生长的对数生长期，生长至湿细胞密度为100 g/L左右时培养基里的甘油完全被消耗，进入甘油补料培养阶段。经过3.5 h的限制性甘油补料，细胞密度增至160 g/L，同时达到AOX启动子去阻遏的目的，停止甘油补料进入甲醇诱导阶段，在甲醇适应之后开始流加甲醇。图3与图4对比结果表明，在应用常规补料条件时，诱导后期发酵后劲不足，细胞密度和β-半乳糖苷酶产量在诱导后期同时段要低于指数补料策略下的相对应指标，最高的细胞密度和β-半乳糖苷酶产量为410 gWCW/L和40.5 U/mL，低于指数补料的细胞密度442 gWCW/L和β-半乳糖苷酶产量60 U/mL。采用指数补料工艺的β-半乳糖苷酶产量比常规补料策略提高了48%。甲醇指数补料有助于诱导后期毕赤酵母生长及β-半乳糖苷酶生产的稳定，而常规策略里的甲醇补料量可能不足以支持后期的稳定生长和生产。

图3 常规补料策略下重组毕赤酵母的生长（■）和β-半乳糖苷酶的生产（□）过程

图4 甲醇指数补料策略下（0.029/h）重组毕赤酵母的生长（■）和β-半乳糖苷酶的生产（□）过程

3 结论

对分泌表达β-半乳糖苷酶的毕赤酵母高密度发酵进行了研究。以多批预发酵实验为基础，通过线性拟合获得了重组菌株的甲醇比消耗速率与比生长速率的线性关系，建立了甲醇指数补料动力学模型，利用该模型能够在发酵罐上维持特定的比生长速率。考察了甲醇诱导阶段0.010/h、0.029/h、0.043/h和0.058/h四个不同比生长速率对产酶的影响。结果表明，比生长速率对β-半乳糖苷酶生产有显著的影响，过高或过低的比生长速率均不利于β-半乳糖苷酶的积累。最大β-半乳糖苷酶产量60 U/mL在比生长速率为0.029/h时获得。对比试验表明，采用指数补料分批发酵工艺优于常规补料分批发酵工艺。

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（责任编辑：朱小惠）

Production of recombinantβ-galactosidase by Pichia pastoris based on exponential fed-batch fermentation

WEIChun，LIU Lifeng，KONG Lingmin
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

Production of recombinantβ-galactosidase derived from Lactobacillus plantarum by Pichia pastoris was investigated in 5-L bioreactor.A kinetic model of methanol feeding at the exponential rate was established and the effect of specific growth rate on theβ-galactosidase production was examined.In methanol induction phase，four specific growth rates，0.010/h，0.029/ h，0.043/h and 0.058/h，were investigated.The specific growth rate was found to play a significant role on theβ-galactosidase production.Themaximumβ-galactosidase production(60 U/mL)was achieved at a specific growth rate of 0.029/h.Compared with the regular feeding strategy，the exponential feeding ofmethanol could afford higherβ-galactosidase production，especially during the later stage ofmethanol induction.

Pichia pastoris；β-galactosidase；exponential feeding；specific growth rate

TQ92

A

1674-2214(2015)04-0006-04

2015-08-03

浙江省自然科学基金项目（LY12B06010）

魏春（1977—），男，浙江新昌人，副教授，博士，主要从事发酵工程的研究，E-mail：springweispring@163.com.