徐 勇,林小聪,文锦丽,李 宁,张宇明,陈文标,喻祥琪,戴 勇△

(1.广东省深圳市坪山新区人民医院 518118;2.广东医学院生物化学与分子生物学研究所,广东湛江 524023;3.广东省深圳市人民医院临床医学研究中心 518020;4.广东医学院附属医院血液科,广东湛江 524001)



·论 著·

急性髓性白血病全基因组miRNA表达谱研究*

徐 勇1,林小聪2,文锦丽3,李 宁4,张宇明4,陈文标3,喻祥琪3,戴 勇3△

(1.广东省深圳市坪山新区人民医院 518118;2.广东医学院生物化学与分子生物学研究所,广东湛江 524023;3.广东省深圳市人民医院临床医学研究中心 518020;4.广东医学院附属医院血液科,广东湛江 524001)

目的 通过比较微小RNA(miRNA)在急性髓性白血病 (AML)与对照组骨髓样本中的表达情况，发现在AML中异常表达的miRNA。方法 提取骨髓样本总 RNA，应用Illumina高通量测序技术对15例 AML患者(AML组)和10例骨髓象正常的贫血或发热原因待查患者(对照组)骨髓样本中的miRNA 表达水平进行检测，分析比较二者miRNA表达的差异。结果 AML样本与对照样本间差异表达的miRNA 共307种，其中232种miRNA在AML组呈表达上调，75种miRNA呈表达下调。结论 多种miRNA 在AML患者的骨髓样本中异常表达，提示它们可能在AML发生和发展过程中起重要调控作用。

急性髓性白血病; 微小RNA; Illumina测序; 表达谱

急性髓性白血病(AML)是一类髓系造血干/祖细胞起源的克隆增生性急性血液系统恶性肿瘤，其病死率在血液系统恶性肿瘤中居于首位[1]。AML病因复杂，发病机制尚不完全清楚，其预后在最近30年无明显改善[2-3]。因此，迫切需要寻找新的分子靶点和治疗方法。微小RNA(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的内源性单链小片段非编码RNA分子[4]。miRNA可在转录水平或转录后水平调节基因表达，属于广义的表观遗传学范围[5]。miRNA与AML关系密切，可能成为AML潜在的治疗靶点[6-7]。目前少有通过miRNA测序技术在AML患者骨髓样本中系统性研究miRNA表达谱的报道。因此，本文通过Illumina高通量测序技术对AML患者全基因组miRNA表达谱进行差异表达分析，为探讨AML相关发病机制及寻找新型的AML治疗靶点奠定良好的基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 15例AML患者的骨髓标本(AML组)来自深圳市人民医院2012年8月至2014年2月的住院患者，其中男9例，女6例，年龄18～77岁，平均40岁。全部AML患者均符合 FAB 国际分型的诊断标准，且均为初发病例，在采样前均未接受化疗或放疗。10例骨髓象正常的贫血或发热原因待查患者的骨髓标本(对照组)收集自广东医学院附属医院2012年3月至2014年1月的住院患者，其中男6例，女4例，年龄10～73岁，平均39岁。

1.2 材料 红细胞裂解液和乙二胺四乙酸抗凝管购自BD公司；无RNase的DNase Ⅰ为Promega公司产品；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；3′与5′ small RNA测序接头、反转录引物、聚合酶链反应(PCR)扩增引物、TruSeq Rapid SR cluster试剂盒及TruSeq Rapid SBS试剂盒均为Illumina公司产品。

1.3 样本采集和保存 患者行骨髓穿刺采集2 mL 骨髓样本于乙二胺四乙酸抗凝管中，加入2 mL 细胞裂解液，混匀，静置7 min，1 200 r/min离心4 min，弃去上层红色上清液，收集沉淀部分；加入灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)2 mL溶解后转移至另一灭菌1.5 mL的EP管中。1 200 r/min离心4 min，弃上清液，沉淀中加入灭菌PBS 2 mL稍微混匀，1 200 r/min离心4 min，弃上清液，收集沉淀，-80 ℃保存。

1.4 方法

1.4.1 总RNA提取 骨髓样本的预处理是将骨髓样品加入2 mL的TRIzol试剂，用电动匀浆器进行匀浆。然后按TRIzol说明书提取组织总RNA，并加入无RNase的DNase Ⅰ进行处理以去除基因组DNA的污染。NanoDrop ND-1000全波长紫外分光光度计在230、260及280 nm波长分别测定吸光度(A)值，计算RNA样品的浓度并分析其纯度。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

1.4.2 测序文库的构建及质量评估 总RNA在T4RNA连接酶的作用下加上3′、5′ small RNA测序接头，所得产物经RT-PCR扩增及聚丙烯胺凝胶电泳纯化生成small RNAs文库，然后通过Agilent 2000 Bioanalyzer对文库进行定量和质量分析。以片段长度峰值在130～155 nt且定量大于或等于1 fmol为文库质量完好，可用于测序文库的簇生成及Illumina测序分析。

1.4.3 DNA簇生成和Illumina测序 将small RNAs文库样品稀释至8 pmol，使用Illumina cBot簇生成系统按TruSeq Rapid SR cluster试剂盒说明书进行测序文库的克隆扩增，然后在Illumina HiSeq 2000测序仪上按照TruSeq Rapid SBS试剂盒说明书进行高通量深度测序。Small RNAs文库的构建、DNA簇生成及测序均在康成生物公司的协助下完成。

1.4.4 Small RNA 测序数据的处理 Illumina HiSeq 2000测序所得的扫描图像输入Off-Line Basecaller软件进行图像分析、读取碱基序列，获得原始数据；并进行去接头、去污染、去低质量、去冗余等处理，获得高质量的干净序列(序列长度为16～30 nt)并进行序列长度分布分析。随后利用Novoalign program软件将干净序列与miRBase数据库中已知的人类pre-miRNA进行序列比对(碱基错配小于或等于1)，获取两组样本已知的miRNA表达丰度等信息。

1.4.5 样品间miRNA差异表达 为了使各样本所有的miRNA表达水平都处于同一个量级，首先对miRNA的表达丰度进行标准化处理[公式：标准化表达丰度(TPM) = miRNA表达丰度/样品中全部miRNA的总表达丰度×106]。差异表达比较时，为了过滤掉两组样本中表达水平均比较低的miRNA，并使某一组样本中标准化表达丰度为0的miRNA也能参与计算，本文参考了Creighton等[7]的方法，在每一个miRNA的标准化表达丰度值中都加入了10TPM来计算差异表达比值。计算公式为：miRNA差异表达比值=(AML组miRNA的标准化表达丰度值+10TPM)/(对照组miRNA的标准化表达丰度值+10TPM)。若miRNA在两组样本间差异表达比值大于或等于2.0或小于或等于0.5，则认为该miRNA在两组样本间具有明显的表达差异；比值大于0.5但小于2.0则为表达差异不显著。若miRNA在两组样本中的标准化表达丰度都小于1 TPM，则该 miRNA不参与差异表达分析。

2 结 果

2.1 样本总RNA的质量检测结果 组织样本经TRIzol试剂分离、提取总RNA 后，应用NanoDrop ND-1000分光光度计对样本总RNA进行质量分析(表1)。结果表明，样本总RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0，A260/A230比值均大于1.6，提示总RNA纯度较高、质量良好。此外，琼脂糖凝胶电泳结果(图1)显示两组样品总RNA均可观察到2条清晰的28 s和18 s电泳条带，表明提取的样本总RNA完整性良好，可用于测序文库的构建。

表1 样本总RNA质量分析

图1 样本总RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 测序文库的质量评估 small RNAs文库经聚丙烯胺凝胶电泳纯化生成后，应用Agilent 2000 Bioanalyzer对文库进行定量(表2)和质量分析。结果表明，对照组与AML组其small RNAs文库的摩尔浓度均超过1 fmol/L，其片段长度均在130～155 nt，提示文库质量完好，可用于测序文库的簇生成及Illumina测序分析。

表2 测序文库定量分析

2.3 两样本small RNA的序列长度分布 Illumina HiSeq 2000测序所得的small RNA序列经去接头、去污染、去低质量、去冗余等处理。对照组和AML组分别获得1 104 855与1 828 670条高质量的干净序列(序列长度为16～30 nt)，均呈正态分布于22 nt序列两侧(图2)。其中20～24 nt序列所占比例最高，其在对照组与AML组分别占88.99%和75.03%，提示small RNA序列可以用于后续的miRBase数据库序列比对和表达分析。

图2 两组样本small RNA文库的序列长度分布

2.4 miRNA的差异表达分析 将干净序列与miRBase数据库中已知的人类pre-miRNA全基因组序列进行序列比对，获得已知的miRNA表达丰度，再进行标准化和miRNA差异表达比值计算。结果表明，两样本共检出307种具有明显差异表达的miRNA，其中232种miRNA呈表达上调，75种miRNA呈表达下调，上调和下调差异最显著的前10种miRNA见表3。上调miRNA的差异表达比值范围为2～1 144，其中表达比值最高的miRNA为miR-206。而下调miRNA的差异表达比值范围为0.005～0.500，其中表达比值最低的miRNA为miR-941。

表3 表达上调和下调差异最显著的前10种miRNA

3 讨 论

AML 是老年人中最常见的一种急性血液系统恶性肿瘤，其预后差、病死率高。随着近年来对AML发病机制研究的不断深入，发现了一些具有价值的诊断标志物和治疗的分子靶点，同时也提出了一些更有针对性的治疗方案且取得了一定效果。但对于老年AML患者，包括化疗、自体外周血干细胞移植等多种方法都不能提高总体疗效，迫切需要寻找新的分子靶点和治疗方法。

miRNA是一类内源性小片段单链非编码RNA分子，其基因在基因组上主要定位于基因间隔区及内含子区，具有独立的启动子、增强子等表达调控元件，可独立完成自身基因的转录过程。miRNA可通过诱导靶mRNA降解或干扰其翻译来调节靶基因表达，在个体生长发育、细胞分化、细胞凋亡、机体代谢及肿瘤形成等过程中发挥重要的调控作用[8]。

研究表明，多种miRNA在AML中呈高表达并可作为原癌基因促进肿瘤细胞增殖。miR-125b在AML中呈高表达，它可以通过作用于其靶基因p53及前凋亡蛋白基因Bak1和Bmf等多种方式抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生[9]。O′connell等[10]研究发现，在骨髓造血干细胞中过表达miR-125b然后移植小鼠可导致小鼠产生AML，提示miR-125b在AML中起癌基因的功能。有研究表明，miR-155过表达的转基因小鼠最初在脾脏和骨髓中显示出白血病前期的前B细胞增殖迹象，然后出现明显的B细胞增殖，表明miR-155能促进多克隆扩增并具有癌基因功能。随后的研究发现，miR-155在AML患者骨髓样本中呈高表达，而在小鼠的骨髓造血干细胞中过表达miR-155可促进粒细胞和单核细胞的增殖并呈现AML的特征[11]。在本研究中，与对照组相比，miR-125b-5p、miR-125b-2-3p和miR-125b-1-3p 3个miR-125b家族的成员及miR-155-5p均呈明显表达上调，其差异表达比值分别为26.3、6.9、6.5和16.5，提示这些miRNA可能与AML相关，具有潜在的研究价值。

某些miRNA在AML中呈低表达，并可通过激活抑癌基因或诱导粒细胞向成熟细胞分化，进一步发挥其抗肿瘤作用。Garzon等[12]的研究表明，miR-29b可通过作用于其靶基因DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B，下调DNMT3A和DNMT3B表达；亦可通过作用于DNA甲基转移酶DNMT1的转录因子Sp1间接下调DNMT1的表达，从而引起DNA甲基化水平下降并导致抑癌基因p15激活，提示miR-29b具有潜在的抑癌活性。Gong等[13]研究发现，与健康对照组相比，miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b和miR-29c)在AML患者外周血单个核细胞和骨髓细胞中均呈显著低表达，而在AML细胞中过表达miR-29a、miR-29b和miR-29c均可通过作用于其共同的靶基因AKT2及CCND2抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。Fazi等观察到反式维甲酸可通过诱导转录因子C/EBPα结合于miR-223的启动子，上调miRNA-223表达，诱导早幼粒细胞向成熟粒细胞分化，从而发挥其抗白血病作用。而在AML细胞NB4中通过慢病毒载体过表达miR-223亦可取得同样的效果，表明miR-223在反式维甲酸诱导早幼粒细胞向成熟粒细胞分化过程中具有重要作用。随后的研究证实，miR-223在AML骨髓样本中呈低表达，而在AML细胞中过表达miR-223可通过作用于其靶基因核转录因子E2F1促进细胞增殖及诱导细胞周期阻滞于G0/G1期[14]。本研究中miR-29b家族的成员miR-29b-3p及miR-233的家族成员miR-223-3p在AML组均呈显著低表达，其差异表达比值分别为0.125和0.036，提示这些miRNA可能与AML相关，亦具有潜在的研究价值。

本文还发现来自于同一个miR-183基因簇(包括miR-182、miR-96和miR-183)的3个miRNA，其调控方式并不一致，其中miR-183-5p及miR-182-5p呈表达上调，而miR-96-5p呈表达下调。由此提示同一miRNA基因簇中不同的miRNA可能存在各自不同的调控方式。

综上所述，本研究应用高通量测序技术对AML全基因组miRNA的表达谱进行了研究，初步探讨了miRNA表达紊乱与AML之间的关系。发现了多种差异显著的miRNA可能与AML相关，可作为AML潜在的分子靶点，但其在AML中的作用及其相关分子机制仍有待进一步研究。

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Whole-genome microRNA expression research in acute myeloid leukemia*

XUYong1,LINXiao-cong2,WENJin-li3,LINing4,ZHANGYu-ming4,CHENGWen-biao3,YUXiang-qi3,DAIYong3△

(1.ShenzhenPingshanPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518118,China;2.InstituteofBiochemistryandMolecularBiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524023,China;3.ClinicalMedicalResearchCenter,ShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518020,China;4.DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524001,China)

Objective To investigate the differentially expressed microRNA (miRNA) of bone marrow samples between the patients with acute myeloid leukemia (AML) and their controls.Methods Total RNAs were extracted from the bone marrow samples of 15 acute myeloid leukemia patients (AML group) and 10 unexplained anemia or fever patients with normal bone marrow morphology(control group),then were applied to perform global miRNA expression analyses by Illumina deep sequencing technology.Results In total,307 differentially expressed miRNAs including 232 up-regulated and 75 down-regulated miRNAs were indentified in AML group compared with control group according to the high-throughput sequencing data.Conclusion The altered expression profile of miRNA in bone marrow samples of AML patients implies that differentially expressed miRNAs maybe plays roles in the pathogenesis of AML.

acute myeloid leukemia; microRNA; Illumina sequencing; expression profile

深圳市知识创新计划基础研究项目(JCYJ20130401093116731)。

徐勇，男，博士，主任技师、研究员、教授，主要从事基础医学与检验医学研究。

△通讯作者,E-mail:daiyong2222@gmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.007

A

1672-9455(2015)03-0304-04

2014-07-06

2014-10-19)