舒 颖，张平安，童永清

(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)



·论 著·

TLR4基因rs4986790和rs4986791位点多态性与幽门螺杆菌感染的研究*

舒 颖，张平安△，童永清

(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)

目的 检测湖北地区人群Toll样受体4(TLR4)基因rs4986790和rs4986791位点单核苷酸多态性，以及与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系。方法 收集2012年12月至2013年6月在武汉大学人民医院内镜中心进行胃镜活检的就诊患者326例，同时采集患者外周血。采用免疫胶体金法检测患者外周血中Hp抗体。采用等位基因特异性聚合酶链反应检测TLR4基因 rs4986790和rs4986791位点多态性。结果 TLR4 基因rs4986790位点在所有研究对象中基因型均为AA型，TLR4基因rs4986791位点在所有研究对象中基因型均为CC型。结论 湖北地区人群TLR4基因rs4986790和rs4986791位点不存在多态性，湖北地区人群Hp感染与rs4986790和rs4986791 2个位点多态性不存在相关性。

Toll样受体4基因； 单核苷酸多态性； 幽门螺杆菌

幽门螺杆菌(Hp)是一种多鞭毛、螺旋状、微需氧的革兰阴性菌，是人类最常见的慢性感染菌之一，定居在人体胃黏膜表层的黏膜层，感染后不予治疗可能会终生定植。1982年Warren和Marshall从人胃黏膜中分离培养出Hp后，经过20多年的研究表明，Hp为慢性活动性胃炎的主要致病菌，是消化性溃疡的重要致病因素，是胃癌重要的危险因素，世界卫生组织已将其列为一类致癌物[1]。然而，在不同人群中，Hp感染率并不相同，全球Hp感染率大约占50.00%[2-3]，我国自然人群Hp总感染率为56.22%[4]，湖北地区Hp感染率为58.90%[5]。Hp感染除了与所接触到的细菌数量、细菌毒力及环境因素存在一定的关系外，还可能与宿主本身的遗传易感性有一定的关系。Toll样受体4(TLR4)是革兰阴性细菌脂多糖(LPS)的受体，在LPS诱导的信号转导途径中起着重要作用。因此，本文拟探讨湖北地区人群中TLR4基因rs4986790和rs4986791位点多态性与Hp感染的关系，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年12月至2013年6月在武汉大学人民医院内镜中心进行胃镜活检的就诊患者326例,男202例，女124例，平均年龄(46.8±6.3)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集所有研究对象空腹静脉血3 mL，取1 mL分离出血清，-20 ℃保存备用；2 mL置于乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝试管中充分混匀，-20 ℃保存备用。

1.2.2 Hp抗体检测 采用免疫胶体金法检测Hp抗体，试剂盒由深圳市惠安生物科技有限公司提供，灵敏度92.3%，特异性97.7%。

1.2.3 仪器与试剂 全血基因组DNA提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)，超微量核酸分析仪ND-2000(美国Thermo Scientific公司)，ABI 9700基因扩增仪和DYY-6C电泳仪(北京六一公司)，ABI3130测序仪和测序所用试剂(美国Applied Biosystem公司)。

1.2.4 引物设计 参照Genbank中TLR4基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物。针对单核苷酸多态性(SNP)位点rs4986790设计2对特异性引物，用来鉴别rs4986790基因的3种基因型(GG型、AA型和GA型)。针对SNP位点rs4986791设计2对特异性引物，用来鉴别rs4986791基因的3种基因型(CC型、TT型和CT型)。引物序列见表1。

表1 SNP位点基因多态性扩增引物

1.2.5 基因组DNA提取 采用基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA，操作过程参照试剂盒使用说明书。DNA提取完成后-20 ℃保存备用。

1.2.6 等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)扩增 采用MBI Ferments 2×PCR mix反应液配制PCR扩增体系。rs4986790 PCR扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 10 min。rs4986791 PCR扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 10 min。整个反应过程在ABI 9700基因扩增仪上完成。

1.2.7 基因型判读 取10 μL PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统分析rs4986790和rs4986791基因型。对于同一位点，如果仅出现突变型引物扩增产物，则判定该位点为突变型，如果仅出现野生型引物扩增产物，则判定该位点为野生型，如两种引物均出现扩增产物，则为杂合子。

1.2.8 DNA测序验证 采取简单随机抽样的方法挑选30份不同基因型的DNA样本，进行PCR后将扩增产物进行凝胶电泳，回收并纯化上述DNA条带，在ABI3130测序仪上进行测序分析。

2 结 果

2.1 Hp抗体检测结果 采用免疫胶体金法检测326例研究对象血清标本，Hp抗体阳性患者有210例，Hp抗体阴性患者116例。

2.2 DNA测序法与AS-PCR检测rs4986790和rs4986791位点多态性的比较 见图1、2。以DNA测序法作为金标准，两种方法检测的30份标本rs4986790和rs4986791基因型符合率为100%。

2.3 TLR4基因rs4986790和rs4986791位点基因型检测情况 对326例DNA样本进行分析，均未发现TLR4基因rs4986790位点和rs4986791位点有突变。即rs4986790多态性位点均为野生型A而未见突变型G，rs4986791位点均为野生型C而未见突变型T(图3)。

注：A为DNA测序法检测结果；B为AS-PCR检测结果。

图1 DNA测序法与AS-PCR检测rs4986790基因型结果

注：A为DNA测序法检测结果；B为AS-PCR检测结果。

图2 DNA测序法与AS-PCR检测rs4986791基因型结果

图3 TLR4基因rs4986790和rs4986791位点各基因型分布

3 讨 论

Toll样受体家族(TLRs)是近年来发现的在抗病原微生物免疫防御反应中起重要作用的受体蛋白，能通过识别细菌、病毒等病原体的相关模式分子，启动天然免疫和调节免疫反应，在联系天然免疫和获得性免疫中也起桥梁作用。近年来有研究表明，TLR在Hp感染所致胃部炎性反应中起至关重要的作用。迄今，在人类已发现了10个TLRs(TLR1～TLR10)，它们多表达于抗原提呈细胞及上皮细胞[6]。TLR4基因是当前研究最为广泛的TLRs，其主要配体为细菌LPS、病毒的包膜蛋白等[6]。有研究表明，TLR4能将LPS传导通路的信号迅速传至核内，激活核转录因子κB通路，刺激一氧化氮分泌，消灭病原；此外，还能激活有关细胞因子表达，释放促炎细胞因子，激活特异性免疫反应，最终在机体的先天性免疫中起重要作用[7]。

对于TLR4基因rs4986790和rs4986791 2个位点多态性与Hp感染相关性疾病的研究，不同学者有不同的意见。Bagheri等[8]的研究表明，在伊朗人群中，TLR4 基因rs4986790突变能够增加Hp感染相关性胃炎患病风险；Oliveira和Silva[9]的研究表明，在巴西人群中，TLR4基因rs4986790突变与胃癌有明显的易感相关性；Santini等[10]在研究意大利人群TLR4基因多态性与胃癌的关系中表明，rs4986791突变能明显增加胃癌的患病风险；Garza-Gonzalez等[11]报道墨西哥人群中TLR4基因rs4986790和rs4986791的突变均与晚期胃癌的患病无易感相关性。在本研究中，通过对TLR4基因 rs4986790和rs4986791 2个位点的多态性进行检测，发现326例研究对象中均未发现有上述突变，这与Zheng等[12]和Hang等[13]的研究结果一致。此外，类似的结果在日本人群中也有报道[14]。由此提示上述2个位点等位基因突变在中国人群乃至亚洲人群中可能极少见或者根本没有突变。这也说明，由于种族和地域差异，TLR4基因rs4986790和rs4986791基因多态性有一定差别，并且与疾病的关系也存在明显差异。

综上所述，本研究在湖北地区人群中并没有检测到TLR4基因rs4986790和rs4986791位点多态性，TLR4基因rs4986790和rs4986791位点多态性可能与湖北地区人群Hp感染并无相关性。至于TLR4基因其他多态性位点及TLR家族的其他一些基因多态性位点与Hp感染关系还有待进一步研究。

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Research of rs4986790 and rs4986791 single nucleotide polymorphisms in TLR4 and susceptibility of helicobacter pylori infection*

SHUYing，ZHANGPing-an△，TONGYong-qing

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To access the the possible contribution of Toll 1ike receptor 4(TLR4) gene rs4986790 and rs4986791 polymorphism and to define association between TLR4 genotype and susceptibility of helicobacter pylori infection.Methods A total of 326 patients who had been examined by gastroscopy were obtained from the endoscopy center of Renmin Hospital of Wuhan University between December 2012 and June 2013.Immune colloidal gold method was used to testing the serological Hp antibody of all the patients.The TLR4 gene rs4986790 and rs4986791 polymorphisms were examined by alleles specific polymerase chain reaction.Results All the individuals had the same TLR4 rs4986790 genotypes(AA),and all the individuals had the same TLR4 rs4986791 genotypes(CC).Conclusion None polymorphisms of rs4986790 and rs4986791 were detected in Hubei populations,and showed no relationship between TLR4 genotype and susceptibility of helicobacter pylori infection.

Toll like receptor 4 gene； single nucleotide polymorphism； helicobacter pylori

国家临床重点专科建设项目资助[财社(2010)305号]。

舒颖，女，在读硕士，主要从事感染性疾病的免疫遗传学研究。

△通讯作者,E-mail:zhangpingan@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.003

A

1672-9455(2015)03-0295-03

2014-08-20

2014-10-22)