刘悦越，高加梅，范行良，杜加亮，刘 艳，国 泰

△(中国食品药品检定研究院，北京 100050)



·论 著·

血浆中丙型肝炎病毒核酸在不同保存条件下的稳定性*

刘悦越，高加梅#，范行良，杜加亮，刘 艳，国 泰

△(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

目的 探讨不同保存条件和时间对丙型肝炎病毒(HCV)RNA稳定性的影响。方法 将22份血浆样本置于-20 ℃保存4周，4 ℃保存12 d，室温(20～25 ℃)保存7 d，反复冻融5次，采用荧光定量聚合酶链反应测定HCV RNA水平，考察HCV RNA稳定性。结果 样本在-20 ℃保存4周HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14 lg，±95%CI≤0.20 lg；4 ℃保存12 d HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39 lg，4 ℃保存12 d时95%CI下限为-0.50 lg，<12 d时±95%CI≤0.24 lg；室温保存7 d HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40 lg，室温保存7 d处理组95%CI下限为-0.53 lg，<7 d时±95%CI≤0.29 lg；反复冻融5次HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10 lg，±95%CI≤0.15 lg。结论 血浆样本在-20 ℃保存4周、4 ℃保存9 d、室温保存5 d和反复冻融5次时，对HCV RNA水平影响不明显，但4 ℃保存12 d或室温保存7 d后，RNA水平显著降低，所以应避免在这种条件和时间下保存和运输血浆。

丙型肝炎； 核酸； 稳定性

对丙型肝炎病毒(HCV)进行核酸筛查能够显著缩短HCV筛查的窗口期[1]，同时，定量测定HCV RNA是临床诊断、临床抗病毒药物疗效评估和预后的重要指标[2]。但由于RNA不稳定，易受环境影响，因此样本保存和处理不当会直接影响HCV筛查或核酸定量的检出率和准确性。另一方面，HCV核酸标准品的存放条件也对其质量有影响，会进一步影响对诊断试剂的评价和试验结果的判断。一些研究者曾报道不同的样本采集处理，如血清、血浆、不同抗凝剂下的抗凝全血在不同保存温度下会影响HCV RNA的稳定性[3-4]，但其着重点在于样本的采集处理对HCV RNA稳定性的影响。在保存温度方面考察的时间较短，且针对HCV RNA水平较高，约为106copy/mL的强阳性样本，由于HCV核酸标准品的标准存放条件为-70 ℃及以下，因此本研究以样本置于-70 ℃作为对照，采用涵盖HCV RNA水平高、中、低的血浆样本，全面考虑样本可能存放的温度环境和时间，系统考察不同保存温度在较长时间内和反复冻融对HCV RNA稳定性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 22份血浆样本均来自献血员，经检测HCV RNA为阳性。

1.2 仪器与试剂 ABI7500荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪。HCV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)[凯杰生物工程(深圳)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 样本处理 将22份HCV RNA阳性血浆样本分别分装于1.5 mL无菌离心管中，每管1 mL，采用不同温度保存处理，设为处理组。将分装好的样本分别放置于以下条件：-20 ℃保存1、2、3、4周；4 ℃保存3、6、9、12 d；室温(20～25 ℃)保存1、3、5、7 d；冻融处理：反复冻融1、3、5次。处理完成后，放入-70 ℃冻存，等待统一检测，并以分装后即刻放入-70 ℃冻存的样本作为对照组。

1.3.2 HCV RNA水平测定 采用凯杰生物工程(深圳)有限公司的HCV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行核酸提取和PCR扩增检测。核酸提取：按照试剂盒说明提取核酸。同时设HCV阴性对照品、HCV临界阳性对照品、HCV强阳性对照品。向1.5 mL的灭菌离心管中分别加入25 μL蛋白酶溶液。并加入待测样本200 μL和新鲜配制的裂解液，盖上盖子，振荡15 s，充分混匀，于56 ℃温浴15 min。加入250 μL无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀(振荡15 s)。15～25 ℃下静置5 min，转入加套管的核酸纯化柱，6 000 g离心1 min。倒掉套管中的废液，将提取柱重新放入套管中。向核酸纯化柱中加入500 μL洗液1，6 000 g离心1 min，倒掉套管中的废液，将提取柱重新放入套管中。加入500 μL洗液2，6 000 g离心1 min，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。加入500 μL无水乙醇，6 000 g离心1 min，丢弃套管，将提取柱放入新的收集管中，20 000 g高速离心3 min，彻底去除乙醇。丢弃收集管，将核酸纯化柱放入干净的1.5 mL离心管中，打开提取柱的盖子，56 ℃温浴3 min，以彻底去除残留的液体。将核酸纯化柱放入另一干净的1.5 mL离心管中，加入60 μL 洗脱液，盖上盖子，20～25 ℃静置5 min。20 000 g高速离心1 min，收集滤出液，做好标记，4 ℃保存备用。提取的病毒核酸应在2 h内用于PCR扩增。PCR扩增检测：按照试剂盒说明配置反应液，每个反应体系含有HCV RT-PCR反应液28 μL，酶混合物2 μL。取待测样品的核酸提取物20 μL，反应总体积50 μL。扩增和检测参数为50 ℃，30 min；95 ℃，15 min；95 ℃，15 s，50 ℃，45 s，72 ℃，15 s，荧光信号收集设在50 ℃，45个循环；反应体系50 μL。扩增检测的结果根据设置的HCV定量标准品相应浓度由仪器软件自动分析给出结果。

1.4 统计学处理 将样本各处理组各时间点的检测结果进行对数转换，并计算均数和标准差。计算处理组与对照组的差值平均值、标准差和差值的95%置信区间(CI)。采用SPSS 19.0软件对各组处理的结果进行Friedman检验，比较同一温度下所有处理组与对照组结果差异是否有统计学意义。如差异有统计学意义，再进行各处理组与对照组结果比较，统计两组差异是否有统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。分子试验的试验内标准差为0.50 lg，因此如果差值或95%CI在±0.50 lg以下，即不认为核酸水平显著降低[5-7]。

2 结 果

2.1 样本中HCV RNA水平 本研究中22份样本HCV RNA水平及其对数转换值见表1。对分装后即刻放入-70 ℃冻存的对照组样本进行检测，其HCV RNA水平在7.76×102～2.60×106U/mL，覆盖高、中、低浓度，均值为1.95×105U/mL。

2.2 -20 ℃保存对血浆HCV RNA稳定性的影响 处理组与对照组差值平均值、标准差和差值的95%CI见表2。各处理组HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14 lg，±95%CI≤0.20 lg。-20 ℃保存1周和2周的结果与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，-20 ℃保存3周和4周的结果与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，但-20 ℃保存3周和4周之间结果差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 22份样本HCV RNA水平

表2 -20 ℃保存不同时间的血浆HCV RNA稳定性(n=22)

注：-表示无数据。

2.3 4 ℃保存对血浆HCV RNA稳定性的影响 处理组与对照组差值平均值、标准差和差值的95%CI见表3。各处理组HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39 lg，4 ℃保存12 d处理组的95%CI下限为-0.50 lg，其他处理组±95%CI≤0.24 lg。4 ℃保存3、6、9、12 d的结果与对照组之间差异均有统计学意义(P<0.05)，但4 ℃保存3、6、9 d之间结果差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 室温保存对血浆HCV RNA稳定性的影响 处理组与对照组差值平均值、标准差和差值的95%CI见表4。各处理组HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40 lg，室温保存7 d处理组的95%CI下限为-0.53 lg，其他处理组±95%CI≤0.29 lg。室温保存1 d的结果与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，保存3、5、7 d的结果与对照组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 4 ℃保存不同时间血浆HCV RNA稳定性(n=22)

注：-表示无数据。

表4 室温保存不同时间血浆HCV RNA稳定性(n=22)

注：-表示无数据。

2.5 反复冻融对血浆HCV RNA稳定性的影响 处理组与对照组差值平均值、标准差和差值的95%CI见表5。各处理组HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10 lg，处理组±95%CI≤0.15 lg。反复冻融3次的结果与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，但反复冻融1次和5次的结果与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，反复冻融1次和5次的结果之间差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 反复冻融的血浆HCV RNA稳定性(n=22)

注：-表示无数据。

3 讨 论

HCV核酸检测在血液筛查预防经输血传播丙型肝炎、临床诊断、评价抗病毒治疗效果和预后中至关重要[8]，待测样本在保存和运输中RNA裂解直接影响病毒的检出，从而增加检测结果为假阴性的可能性。因此待测样本必须在适当条件下进行保存和运输，以保证检测结果的准确性和可重复性。

差异有无统计学意义仅仅是统计结论，不一定在现实中有意义，使用方法和样本量、样本中RNA水平分布的不同会影响结果，因此并不具有决定性作用。判断HCV RNA水平是否显著降低还需要结合专业知识，目前尚无行业标准，根据文献一般认为分子试验的试验内标准差为0.50 lg。因此如果差值或95%CI在±0.50 lg以下，即不认为核酸水平显著降低[5-7]。

曾有一些学者针对HCV血样的保存进行研究。Baleriola等[5]报道样本在-20 ℃冻存1.2年后，HCV RNA水平与对照组相比，差异有统计学意义，但降低不超过0.50 lg，认为这种RNA损失在试验误差范围内，对临床判断的影响不大[6]。本研究结果发现，样本在-20 ℃保存1周和2周的结果与对照组比较差异无统计学意义，-20 ℃保存3周和4周的结果与对照组比较差异有统计学意义。样本在-20 ℃冻存1周后，与对照组相比，HCV RNA水平增加0.03 lg，这种水平升高可能是由于试验误差引起的；冻存2～4周后，HCV RNA水平平均有所下降，但均不超过0.14 lg，±95%CI也小于0.20 lg。

Gessoni等[7]指出，在4 ℃保存7 d的全血样本HCV RNA水平未见显著降低。Sener等[8]的研究表明，非抗凝样本在4 ℃保存5周，其HCV RNA水平仍然稳定。本研究中4 ℃保存3～12 d的结果与对照组比较差异均有统计学意义，但各处理组HCV RNA平均下降幅度不超过0.39 lg，值得注意的是4 ℃保存12 d后处理组的95%CI下限为-0.50 lg，达到了人们普遍接受的分子试验内标准差，其他处理组±95%CI不超过0.24 lg。因此，样本在4 ℃保存12 d可能会影响RNA水平的检测。

Grant等[9]研究表明，血浆样本在25 ℃放置5 d，HCV RNA水平(0.20 lg)显著降低。Comert等[6]的研究表明，室温下放置1、2、3 d与对照组比较差异有统计学意义，但处理组与对照组的HCV RNA差值平均值不超过0.20 lg。而本研究室温保存1 d的结果与对照组比较差异无统计学意义，保存3、6、9 d的结果与对照组之间差异均有统计学意义。各处理组HCV RNA平均下降幅度不超过0.40 lg，但室温保存7 d处理组的95%CI下限为-0.53 lg，分子试验内标准差其他处理组±95%CI均小于0.29 lg，说明样本在室温保存7 d可能会使HCV RNA水平明显降低。

RNA保存最常用的方法是冻存,已有一些学者针对冻存对HCV RNA的影响进行了研究[10-11]。近期Baleriola等[5]报道，样本在-70 ℃冻存9年后，HCV RNA水平与对照组相比，差异有统计学意义，但降低不超过0.50 lg，认为这种RNA损失在试验误差范围内，对临床判断的影响不大。但是反复冻融会影响HCV RNA的稳定性。Gessoni等[7]指出，反复冻融5次后HCV RNA水平显著降低。但Comert等[6]的研究表明，样本经过反复冻融10次，与对照组差异仍无统计学意义。本研究中反复冻融3次的结果与对照组之间差异无统计学意义，但反复冻融1次和5次的结果与对照组之间差异有统计学意义，各处理组HCV RNA平均下降幅度不超过0.10 lg，处理组±95%CI不超过0.15 lg。

以往一些研究结果差异在一定程度上可能与样本的选择，如血清或血浆，乙二胺四乙酸抗凝或柠檬酸盐抗凝等，HCVRNA检测的方法、统计学方法、判断标准及样本量的不同有关。本研究选择22份覆盖HCVRNA高、中、低浓度的血浆样本，通过不同的保存条件和不同的时间，可以总结出：血浆样本在-20℃保存4周、4℃保存9d、室温保存5 d和反复冻融5次，对HCV RNA检测影响不明显，但4 ℃保存12 d和室温保存7 d后，RNA水平显著降低，应避免在这种条件和时间下保存和运输血浆。

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Stability of hepatitis C virus nucleic acid in plasma stored on different conditions*

LIUYue-yue，GAOJia-mei#，FANXing-liang，DUJia-liang，LIUYan，GUOTai

△(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China)

Objective To investigate effects of different storage conditions and time on stability of HCV RNA.Methods Totally 22 plasma samples were stored at different conditions as bellow:-20 ℃ for 4 weeks;4 ℃ for 12 days;room temperature(20-25 ℃) for 7 days;5 freeze-thaw cycles.HCV RNA was determined by RT-PCR to investigate the stability of it.Results The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.14 lg and ±95%CI≤0.20 lg when samples were stored at -20 ℃ for 4 weeks.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.39 lg and ±95%CI≥-0.50 lg when samples were stored at 4 ℃ for 12 days.But ±95%CI≤0.24 lg when samples were stored at 4 ℃ less than 12 days.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.40 lg and ±95%CI≥ -0.53 lg when samples were stored at room temperature for 7 days.But ±95%CI≤0.29 lg when samples were stored at room temperature less than 7 days.The average decline of HCV RNA concentration was less than or equal to 0.10 lg and ±95%CI≤0.15 lg when samples were frozen and thawed for 5 times.Conclusion HCV RNA is stable in plasma samples stored at -20 ℃ for 4 weeks,4 ℃ for 9 days,room temperature for 5 days or after 5 freeze-thaw cycles.But HCV RNA concentration declined dramatically when samples were stored at 4 ℃ for 12 days and room temperature for 7 days.The storage and transportation should be avoided in these conditions.

hepatitis C； nucleic acids； stability

国家科技重大专项课题资助项目(2012ZX10004702)。

刘悦越，女，硕士，助理研究员，主要从事生物制品质量研究。 # 同为第一作者。

△通讯作者,E-mail:guotai@nifdc.org.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.001

A

1672-9455(2015)03-0289-03

2014-07-04

2014-10-22)