解士海，潘武辉，宗国勇，黄小雄

（广东省惠州市皮肤病医院，惠州 516001）

色素障碍性皮肤病一向是皮肤科一大难点，尤其是白癜风，由于其发病确切机制仍然未被明确，涉及多重因素，临床治疗上尚无满意药物。近年来随着对人皮肤着色机制的研究不断深入，色素由黑素细胞向角质形成细胞的转运过程逐渐受到重视。我们前期研究发现龙胆草有促进黑素合成的作用[1]，本研究中进一步探讨龙胆草对黑素小体转运的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 龙胆草：取中药龙胆草置于不锈钢罐内，加相当于药材量8 倍的蒸馏水浸泡1 h，煮沸40 min 后过滤。药渣加6 倍量水后继续煎煮，煮沸30 min 后过滤。合并两次滤液，浓缩成每毫升相当于原药100 mg 的中药药液。

CFDA-SE（二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯），中性酶、胰酶、二甲基亚砜（DMSO）、叠氮钠（PFA）以及四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自Sigma 公司，鼠源抗角蛋白单克隆抗体购自Santa Cruz 公司，结合藻红霜（PE） 的羊抗鼠IgG 购自Boster Biotechology，小牛血清购自杭州四季青公司；高通量多功能微板测试系统（德国BMG），图像信号采集与分析系统（德国LEICA 公司），倒置显微镜，荧光显微镜，流式细胞仪，无菌工作台等。

1.2 方法

1.2.1 取材来源 人表皮黑素细胞与角质形成细胞均来源于12～18 岁正常中国男性常规包皮环切术后的包皮

1.2.2 MTT 实验 将黑素细胞及共培养细胞按1×104/孔接种于96 孔板，在37 ℃及5%CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入含一定药物浓度的共培养培养基200 μL，龙胆草设6 个浓度（0，0.1，0.2，0.5，1，2 g/L），每一浓度设4 个复孔，对照组直接加共培养培养基200 μL，空白孔不加细胞，只加培养基，继续孵育72 h，每孔加入5 g/L 的MTT 溶液20 μL，在37 ℃及5%CO2下孵育4 h，弃上清液，每孔加DMSO150 μL，振荡10 min，在酶标仪490 nm 波长（参考波长620 nm）下测量各孔吸光度值，细胞增殖率＝[（待筛物各浓度平均吸光度值－空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值－空白组平均吸光度值）]×100%。

1.2.3 黑素转运测定实验 黑素转运测定实验主要参考Minwalla 等[2]的方法。简述如下，黑素细胞先与CFDA-SE 孵育，然后与角质形成细胞共同孵育7 d。共培养细胞中加入不同浓度（0.1，0.2，0.5 g/L）的龙胆草以及1.0 mmol/L 的烟酰胺，龙胆草与烟酰胺连续6 d 每12 h 加药1 次，第7 天，用PBS 将贴壁细胞洗脱下来，用含有热灭活胎牛血清及叠氮钠（PFA）的PBS 洗细胞，在4 ℃下将细胞前固定于4%的多聚甲醛内30 min，然后室温下放入荧光激活细胞术（Fluorescence activating cell sorting，FACS）穿透液中10 min，再在室温下与基础抗体共同孵育45 min，基础抗体是鼠源抗角蛋白单克隆抗体，用于在FACS 中鉴别角质形成细胞。用PFA 将细胞再洗3遍，然后与第二抗体[结合藻红霜（PE）的羊抗鼠IgG]37 ℃下共同孵育30 min，用1%多聚甲醛后固定，最后放入检测管在流式细胞仪中检测，CFDA-SE 和PE 可以同时被488 nm 氩离子激光激发，CFDA-SE荧光与PE 荧光可分别通过525 nm 以及575 nm 波长带通滤波器检测，黑素细胞只有CFDA-SE 阳性，角质形成细胞PE 阳性，共培养体系中角质形成细胞因为含有黑素细胞转运过来的黑素小体同时具有CFDA-SE 和PE 阳性，空白对照是取不加任何实验物的共培养体系中含有转运来的CFDA-SE 的角质形成细胞进行检测分析，然后分别检测含各种浓度龙胆草以及1.0 mmol/L 的烟酰胺的共培养体系中角质形成细胞内CFDA-SE 荧光的改变，烟酰胺已被证实有抑制黑素转运的作用，本实验中作为另一个对照。每次测试都选取10 000 个样本，本实验结果采用Coulter SystemⅡ分析，实验重复2 次。

1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS 统计软件进行两因素方差分析检验，通过方差得出P 值，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙胆草对细胞增殖的影响 MTT 实验结果显示龙胆草浓度在（0.1～0.5 g/L）对共培养体系细胞增殖无影响，见表1，试验中每一浓度都重复试验6次，所有浓度实验组均与不加药物对照组对比进行方差分析，得出P 值。

2.2 龙胆草对共培养体系中黑素小体转运的影响用流式细胞仪检测了转运到角质形成细胞的荧光色素的含量，以此评估龙胆草是否影响黑素的转运，结果见表2，共培养体系中，1.0 mmol/L 烟酰胺对与黑素转运有明显的抑制作用，证明本研究体系的可靠性，不同浓度的龙胆草可以剂量依赖地促进黑素的转运。

表1 龙胆草对共培养体系细胞增殖的影响 (n=6)

表2 龙胆草对黑素小体转运的影响

3 讨论

人类皮肤着色涉及黑素在黑素细胞内合成、黑素小体向角质形成细胞转运以及黑素颗粒在角质形成细胞内分布三大过程。一直以来，对于黑素合成研究比较多[3]。近年来，由于免疫荧光技术以及流式细胞仪技术的发展，人们对于黑素转运过程的研究取得一定进展。利用人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）荧光染色，通过共聚焦显微镜观察黑素的转运过程[4]。活体染料CFDA-SE 是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成带负电荷的CFDA-SE，此时的CFDA-SE 才具有荧光性并可以自发不可逆的通过可利用的胺偶联到细胞蛋白质上，一些低转化率的蛋白（如某些细胞骨架成分）可以使其长期稳定的储留在细胞内[5]，因此可以利用这一特性提前标记黑素细胞内包括黑素小体在内的稳定成分，然后与角质形成细胞共培养借助流式细胞仪测定黑素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。1.0 mmol/L 的烟酰胺对共培养体系中黑素细胞及角质形成细胞增殖无影响，已经证明对于黑素小体转运有抑制作用，因此本研究中作为对照药物。

龙胆草出现在许多治疗白癜风的传统中药方剂中，我们通过前期研究研发现其对于黑素合成有一定促进作用，本研究进一步发现龙胆草对于黑素转运同样具有促进作用，龙胆草可以同时促进黑素的合成和转运，是未来开发治疗白癜风的理想药物。

[1] 黄壮峰，解士海.龙胆草在人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系中对酪氨酸酶活性及黑素合成的影响[J].皮肤性病诊疗学杂志，2011，18（4）：258-259.

[2] Minwalla L, Zhao Y, Cornelius J, et al. Inhibition of melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes by lectins and neoglycoproteins in an in vitro model system[J]. Pigment Cell Res,2001,14:185-194.

[3] 刘栋，朱文元. 积雪草甙对酪氨酸酶活性的抑制作用及对Cloudman S91 黑素瘤细胞黑素合成的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2004,3（1）：7-10.

[4] 解士海，陈志强，马鹏程,等.人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察[J].临床皮肤科杂志，2006,35（5）:286-288.

[5] Lyons AB. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution[J]. J Immunol Methods,2000,243:147-154.