李华强，郭春芳，谢黎明，潘永霞　(.重庆市巴南区人民医院病理科,重庆 400;.重庆市巴南区人民医院妇产科, 重庆 400;.重庆市巴南区人民医院神经内科，重庆 400)

TLR4、TLR7蛋白在宫颈鳞癌中的表达及其意义

李华强1，郭春芳1，谢黎明2，潘永霞3(1.重庆市巴南区人民医院病理科,重庆 401320;2.重庆市巴南区人民医院妇产科, 重庆 401320;3.重庆市巴南区人民医院神经内科，重庆 401320)

[摘要]目的探讨Toll样受体4、7(TLR4、TLR7)蛋白在宫颈鳞癌(CSCC)组织中的表达变化及与患者的临床病理特征的关系。方法选取本院67例确诊CSCC患者的癌组织标本(CSCC组)、30例宫颈上皮瘤变患者的宫颈组织标本(CIN组)及30例正常宫颈组织标本(正常组)，采用免疫组化染色法检测3组标本中的TLR4、TLR7蛋白表达水平差异，并分析CSCC组织标本中TLR4、TLR7蛋白表达与患者的临床病理特征的关系。结果CSCC组的TLR4、TLR7蛋白表达阳性率分别为80.60%、76.12%，均显著高于CIN组的46.67%、40.00%和正常组的13.33%、10.00%，且差异均具有统计学意义(P<0.05)；CIN组的TLR4、TLR7蛋白阳性表达率显著高于正常组(P<0.05)。TLR4蛋白阳性表达与CSCC 患者的FIGO分期、病理分级、浸润深度有显著的关系(P<0.05)；TLR7蛋白阳性表达与CSCC 患者的病理分级、浸润深度有显著的关系(P<0.05)。结论TLR4、TLR7蛋白在CSCC患者宫颈组织中表达阳性率显著升高，并且与患者的临床分期、病理分级等因素有一定的关系。

[关键词]Toll样受体；宫颈鳞癌；宫颈上皮瘤变；病理特征

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是重要的跨膜蛋白，是人体的天然免疫分子，能够识别不同病原微生物的相关分子模式，在发挥机体免疫功能中扮演重要角色[1]。近年研究显示，在不同类型的恶性肿瘤组织中均可发现TLRs的表达，表明TLRs参与了恶性肿瘤的发生及进展，其机制可能与TLRs抑制细胞凋亡、促进免疫逃逸，参与炎症反应过程有关[2]。但是，对于子宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)，TLRs在癌组织中的表达及其影响作用尚不明确。本研究采用免疫组化、荧光定量PCR检测以及western blot对CSCC组织及癌旁组织中TLR4与TLR7

的表达水平，探讨TLR4与TLR7对CSCC发生、发展的影响，旨在进一步明确TLRs对CSCC肿瘤生物学行为的意义，现报告如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选取本院67例确诊CSCC患者的癌组织标本(CSCC组)、30例宫颈上皮瘤变患者的宫颈组织标本(CIN组)及30例正常宫颈组织标本(正常组)进行分析。CSCC组67例患者，年龄37～64岁，平均(46.52±9.18)岁。根据国际妇产联盟(FIGO)分级标准：Ⅰa期2例、Ⅰb期7例、Ⅱa期12例、Ⅱb期18例、Ⅲa期20例、Ⅲb期8例。病理检查分级：G1期15例、G2期28例、G3期24例，淋巴结转移26例。CIN组30例患者，年龄28～58岁，平均(44.57±10.26)岁，CINⅠ11例 CINⅡ 12例、CINⅢ 7例。正常组30例，年龄30～60岁，平均(45.83±11.27)岁。3组研究对象的年龄构成差异不具有统计学意义(P>0.05)。纳入标准：CSCC患者的宫颈组织标本来源于本院手术切除后的经病理活检确诊的CSCC患者；宫颈上皮瘤变患者组织标本来源于阴道镜取活组织病理检查确诊的患者；正常宫颈组织标本来源于本院妇科检查活组织检查证实为正常的宫颈组织标本；宫颈癌患者及CIN患者取标本前均未接受放疗、化疗或者免疫治疗。排除标准：未经过病理检查证实的患者；取标本前接受过相关治疗的患者；一般资料不完整的患者。

1.2免疫组化检测方法

异硫酸氰胍法提取癌组织标本、宫颈上皮瘤变患者及正常组的宫颈组织标本RNA，提取后-80 ℃冰冻保存。用紫外分光光度计测出总 RNA 的含量。取1∶1RNA 样品稀释成30∶1。在紫外分光光度仪上分别测出A260和A280处的值。计算出 A260/A280的比值；纯度较好的 RNA样品比值应为1.8～2.0。若OD260/OD280小于1.7，说明提取物中混入蛋白，需要重新提取总 RNA，并将实验所RNA浓度调整至20 ng/μL。

1.3免疫组化结果判定标准

免疫组织化学法的结果判定标准，免疫组化染色结果为黄色或棕黄色颗粒，随机选取10个视野在400倍高倍镜下进行观察，按照着色强度进行分级：0分为无色；淡黄色为1分；棕黄色为2分，褐色为3分。显微镜下染色阳性细胞计数：1%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；75%以上为4分。2个得分项目相加为最终评分，(-)为总分低于3分，阴性表达；(+)为3分，弱阳性表达；(++)为4分，中阳性表达；(+++)为5分，强阳性表达。

1.4统计学分析

2结果

2.1TLR4、TLR7蛋白在3种宫颈组织中的表达情况

CSCC组的TLR4、TLR7蛋白表达阳性率分别为80.60%、76.12%，均显著高于CIN组的46.67%、40.00%和正常组的13.33%、10.00%，差异均具有统计学意义(P<0.05)；CIN组的TLR4、TLR7蛋白阳性表达率显著高于正常组(P<0.05)，见表1。免疫组化见图1～2，可见CSCC组的棕黄色颗粒较多，着色较深，CIN组呈黄色或淡黄色着色，较正常组深。

表1　TLR4、TLR7蛋白在3种宫颈组织中的表达[例(%)]

*：与CSCC组比较,P<0.05；#：与正常组比较，P<0.05

a:正常组;b:CIN组;c:CSCC组

图1TLR4蛋白的免疫组化结果(SP,×400)

a:正常组;b:CIN组;c:CSCC组

2.2TLR4、TLR7蛋白的表达与临床病理特征的关系

TLR4蛋白阳性表达与CSCC患者的FIGO分期、病理分级、浸润深度有显著的关系(P<0.05)；TLR7蛋白阳性表达与CSCC患者的病理分级、浸润深度有显著的关系(P<0.05),见表2、表3。

3讨论

TLRs主要存在于机体免疫细胞中，其主要功能是识别病原体的分子模式，调节天然免疫反应，介导炎症反应，发挥抵御病原微生物侵袭的重要作用[3]。新近研究表明，TLR4、TLR7的表达与原发性及感染性肾脏疾病的发病有关[4]。另外，还有研究显示TLRs不仅存在机体的免疫组织中，还存在于不同类型的肿瘤细胞中，例如黑色素瘤、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、喉癌、神经母细胞瘤、肺癌等癌组织细胞中均发现TLRs的广泛表达，因此推测TLRs可能影响恶性肿瘤的发病，而且在其生物免疫治疗中发挥一定作用[5-6]。但是关于CSCC中TLRs的表达尚未明确。本研究探讨了CSCC组织中TLR4与TLR7的表达水平，并与正常组织细胞进行比较，分析TLR4、TLR7与CSCC的发生、发展的关系。

表2　TLR4蛋白的表达与CSCC患者的临床病理特征关系

表3　TLR7蛋白的表达与CSCC患者的临床病理特征关系

肿瘤细胞所处的机体内外环境，是影响肿瘤发生与转移的重要因素。肿瘤组织细胞生存的微环境是一个复杂的网络系统，由各种不同类型的细胞及细胞介质组成。当前，已有不少研究关注TLRs信号通路在肿瘤发病及进展中的影响作用，细胞因子是其中的关键一环，对肿瘤的生长起着复杂的影响作用。感染或机体组织损伤引发的炎症反应能够启动肿瘤的发病过程，而肿瘤生长能够模拟组织损伤的生理机制，诱导TLRs依赖性炎症，进一步促进肿瘤的生长进程[3]。研究表明，TLRs对NK细胞、巨噬细胞等一类机体固有免疫细胞具有活化作用，同时还能够激活下游信号分子，例如核转录因子NF-κB、以及丝裂原活化蛋白激酶、干扰素调节因子1、7等，并通过对抗原递呈细胞的介导作用，参与炎症反应，增加促炎因子的激活水平[7]。TLRs一旦与机体中存在的相应配体相结合，能够促进上皮细胞的表型转变，促进细胞因子的合成，介导肿瘤组织的免疫逃逸，促进肿瘤细胞的生长、转移[8]。肖晶晶等[9]研究指出，在HPV阳性子宫颈癌患者中，可发现TLR4通路关键基因的高水平表达，推测TLR4通路的激活与HPV感染可能存在相关，两者共同调节局部免疫微环境，造成肿瘤细胞的免疫逃逸，诱导子宫颈肿瘤的形成；Hasimu等[10]以维吾尔族患者为研究对象，探讨HPVl6感染与TLR4表达水平的关系，结果表明，子宫颈癌中TLR4水平明显升高，与HPVl6感染显著正相关。Bergman等[11]研究表明头颈部鳞状细胞癌组织中，TLR4水平与肿瘤分级密切相关，但不存在明显的突变基因。

本研究结果显示，CSCC组织TRL4与TRL7的表达阳性率明显高于癌旁组织；CSCC组织TRL4与TRL7的mRNA水平明显高于癌旁组织；CSCC组织TRL4与TRL7的蛋白表达明显高于癌旁组织，提示TLR4、TLR7蛋白与mRNA在CSCC中的表达明显，与癌旁组织存在明显差异。因此我们推测，在CSCC患者的子宫颈微环境中，可能存在TLR4、TLR7蛋白分子的内源性配体，从而诱导TLR4、TLR7信号通路的激活，介导机体局部炎症反应，通过一系列复杂的信号传导途径，TLR4、TLR7能够激活多个下游分子，例如NF-KB、P38、JNK及IFN等一系列调节因子，从而促进癌细胞的生长与增殖，抑制癌细胞凋亡，促进癌细胞浸润及转移。我们认为，TLR4、TLR7可能成为CSCC发病的生理机制以及治疗靶点的研究提供一个新的方向，具有潜在的应用前景。但是，对于TLR4、TLR7在CSCC微环境中的具体作用机制，将是我们以后进一步研究的重要课题。

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(编辑：杨颖)

Expression of TLR4 and TLR7 protein in cervical squamous cell carcinoma

LI Hua-qiang1,GUO Chun-fang1,XIE Li-ming2,PAN Yong-xia3(1.Department of Pathology,the People’s Hospital of Banan,Chongqing 401320,China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics,the People’s Hospital of Banan,Chongqing 401320,China;3.Department of Neurology,the People’s Hospital of Banan,Chongqing 401320,China)

Abstract:ObjectiveTo study the changes of Toll like receptor 4,7 (TLR4,TLR7) protein in cervical squamous cell carcinoma(CSCC) tissues and the relationship between expression and clinical pathological characteristics of the patients. MethodsA total of 67 patients with CSCC carcinoma(CSCC group),30 patients with cervical intraepithelial neoplasia(CIN group) and 30 patients with normal cervical tissues(normal group) were detected by immunohistochemical method.The expression of TLR4,TLR7 protein and its clinical pathological characteristics of patients with CSCC in the samples were analyzed. ResultsTLR4,TLR7 protein positive rate of CSCC group were respectively 80.60% and 76.12%，which were significantly higher than those of CIN group (46.67%,40.00%) and the normal group(13.33%,10.00%),the difference was statistically significant (P<0.05).TLR4,TLR7 protein positive expression rate in CIN group was significantly higher than that in the normal group (P<0.05).The positive expression of TLR4 protein and CSCC in patients with FIGO stage,pathological grade,depth of invasion had a significant relationship(P<0.05),pathological grade,the positive expression of TLR7 protein and CSCC in patients with invasive depth had a significant relationship(P<0.05). ConclusionThere is increased expression of TLR4,TLR7 protein in cervical tissues of CSCC patients,and a certain relationship between the factors and clinical staging,pathological grading.

Keywords:Toll like receptor;cervical carcinoma;cervical intraepithelial neoplasia;pathology

[收稿日期]2015-06-20[修回日期] 2015-07-15

[通讯作者]潘永霞，E-mail:54129839@qq.com

doi:10.11659/jjssx.06E015103

[中图分类号]R365

[文献标识码]A

[文章编号]1672-5042(2015)05-0502-04