辛晓斐，吴 琰，贺彦娜，丁 黎

中国药科大学药物分析教研室，南京210009

人血浆中痕量炔雌醇衍生化LC-MS/MS测定方法的建立及其药动学研究

辛晓斐，吴 琰，贺彦娜，丁 黎*

中国药科大学药物分析教研室，南京210009

目的：建立柱前衍生化测定人血浆中痕量炔雌醇的LC-MS/MS方法，并研究中国健康女性受试者空腹口服左炔诺孕酮炔雌醇片（每片含0.02 mg炔雌醇和0.1 mg左炔诺孕酮）后炔雌醇的药动学特征。方法：血浆样品经过环己烷-乙醚（7∶1）提取吹干后，残渣溶解于pH 10.5的碳酸氢钠溶液中，并用丹酰氯丙酮溶液在60℃反应6 min后进行LC-MS/MS分析。以Hedera ODS-2（2.1 mm×150 mm，5 μm）为分析柱，流动相为含0.1%甲酸的水溶液-甲醇（13∶87），梯度洗脱。炔雌醇丹酰氯衍生物和内标米非司酮的检测离子分别为m/z 530.2→171.1和m/z 430.1→372.2，对中国健康女性受试者空腹口服左炔诺孕酮炔雌醇片后，血浆中炔雌醇的浓度进行测定，并计算主要药代动力学参数。结果与结论：炔雌醇的血药浓度在1.059~211.7 pg·mL-1范围内线性良好，中国健康女性受试者单次和连续21 d口服左炔诺孕酮炔雌醇片后炔雌醇的cmax分别为（58.1±25.1）pg·mL-1和（76.5±19.7）pg·mL-1，tmax分别为（1.8±0.6）h和（1.9±0.9）h，AUC分别为（611±223）pg·h·mL-1和（762±189）pg·h·mL-1，t1/2分别为（12.36±4.42）h和（15.44±3.81）h。以上炔雌醇的药动学特征为首次报道。

柱前衍生化；炔雌醇；丹酰氯；LC-MS/MS；药代动力学

左炔诺孕酮炔雌醇片的炔雌醇和左炔诺孕酮为避孕药的常用成分，能通过抑制卵巢活性达到避孕目的。国外文献报道，该制剂连续服药后炔雌醇的人体稳态血药浓度为（77±30）pg·mL-1，稳态时最低血药浓度为（10.5±5.1）pg·mL-1[1]，因此，为研究该制剂在中国健康女性受试者体内的药动学特征，需建立高灵敏度的方法对血浆中痕量的炔雌醇进行测定。国内外建立了测定炔雌醇的多种方法仍有局限：免疫法[2]专属性差；GC-MS/MS法[3]样品前处理繁琐且分析时间长，不适合高通量样本分析；HPLC法[4]灵敏度不够；LC-MS/MS法[5]可在电喷雾离子化（ESI）或大气压化学离子化（APCI）负离子条件下测定炔雌醇，但是灵敏度仍无法达到本试验的测定要求；柱前衍生化[6]测定炔雌醇的样品处理过程须进一步优化，以满足本试验的测定要求（定量下限为1 pg·mL-1），且衍生化产物稳定性须进一步考察。为此，本文建立了测定人血浆中炔雌醇的LC-MS/MS法，定量下限为1 pg·mL-1，为目前报道的最低值，可用于炔雌醇的药动学研究。此外，本文首次报道了中国健康女性受试者空腹口服左炔诺孕酮炔雌醇片后炔雌醇的人体药动学特征。

1 材 料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱系统 （美国Agilen公司）；API 4000三重四级杆质谱仪，配备电喷雾离子化接口，Analyst Software 1.5.2数据采集软件（美国Applied Biosystems公司）。

1.2 药品和试剂

左炔诺孕酮炔雌醇片 （北京紫竹药业有限公司，批号：43121123，规格：21片，每片含左炔诺孕酮0.1 mg，炔雌醇0.02 mg）；炔雌醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100052-200609，纯度：99.5%）；米非司酮对照品（USP，批号：FDH385）；丹酰氯（日本东京化成工业株式会社，批号：R6U2NTN，含量98.0%）；甲醇和乙腈（为色谱纯，德国Mer-ck公司）；其余试剂均为市售分析纯；水为去离子水。

2 方 法

2.1 色谱、质谱条件

色谱柱：Hanbon Hedera ODS-2（2．1mm×150mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司）；流动相：甲醇-0．1%甲酸水溶液，梯度洗脱（0～3．0min，维持87%甲醇；3．0～3．1 min，87%甲醇线性升至100%甲醇；3．1～7．0 min，维持100%甲醇；7．0～7．1min，100%甲醇线性降至87%甲醇；7．1～10．0 min，维持87%甲醇）；流速：0．5 mL· min-1；进样量：15 μL；进样器控温：15℃；柱温：35℃。

多反应离子监测（MRM）；气动辅助电喷雾离子化（ESI）；离子极性：正离子；检测对象：炔雌醇的丹酰氯衍生物，m/z 530．2→171．1；内标（米非司酮），m/ z 430．1→372．2；碰撞气压力：68．9 kPa；气帘气压力：206．8 kPa；离子源气体1压力：413．7 kPa；离子源气体2压力：344．7 kPa；离子喷射电压：5500 V；离子源温度：500℃。其它参数见表1。待测物质子化分子离子的产物离子质谱图见图1。

表1 待测物的质谱参数设置

图1 待测物质子化分子离子的产物离子质谱图

2.2 溶液的配制

以甲醇为溶剂，配制1．059 mg·mL-1的炔雌醇储备液，并以甲醇逐级稀释，得到浓度分别为105．9、10．59、1．059 μg·mL-1；105．9、10．59、1．059 ng·mL-1；529．3、132．3、52．93 pg·mL-1；6．352、3．176、1．588 ng· mL-1的炔雌醇系列对照品溶液。以甲醇为溶剂，配制1．042mg·mL-1米非司酮的储备液，并以甲醇逐级稀释，得到浓度为5．210 μg·mL-1的米非司酮对照品溶液。

配制浓度为1．086 mg·mL-1的丹酰氯丙酮溶液。

配制浓度为100．8 mmol·L-1的碳酸氢钠水溶液，用氢氧化钠调pH至10．5。

2.3 血浆样品的提取及衍生化处理

于10 mL离心管中精密加入血浆样品1 mL，加入内标溶液（5．210 μg·mL-1）20 μL，旋涡混匀，再加入环己烷-乙醚（7∶1）4．0 mL，涡旋3 min，于4000 r· min-1离心8 min。取上层有机相3 mL，于37℃水浴以氮气流吹干。在提取好的血浆残渣样品中加入100 mmol·L-1碳酸氢钠溶液100 μL（pH 10．5），涡旋1 min，再加入1 mg·mL-1的丹酰氯丙酮溶液100 μL，涡旋1 min，60℃水浴加热6 min。再以15600 r·min-1离心3 min，取上层澄清溶液于自动进样器样品瓶中，进样量15 μL，进行LC-MS/MS分析。

2.4 临床试验方案

12名健康女性受试者，年龄26～43岁，身高（163．1±2．4）cm，体重 （60．9±2．3）kg，体重指数（22．9±0．8）kg·m-2。体格检查显示血压、心肝肾功能和血、尿常规无异常。受试者于试验前两周及试验期间未服用其他任何药物。本试验遵守《赫尔辛基宣言》有关伦理准则，试验方案经中国人民解放军第四军医大学第一附属医院药物临床试验伦理委员会审议通过，受试者自愿参加试验并签署知情同意书。

采用单中心、开放、随机试验。选择符合入选标准的健康成年女性受试者12人进行单次（1片左炔诺孕酮炔雌醇片）及多次给药试验。

单次给药药动学试验：12名健康女性受试者，空腹给药1次（8∶00），在给药前（0 h）和给药后10、20、30、45 min，1、1．5、2、2．5、3、4、6、9、14、24、36、48、72 h分别采集静脉血5 mL于肝素试管中，离心5 min（4000 r·min-1），分离血浆，置-80℃保存待测。

多次给药药动学试验：12名健康女性受试者单次给药结束后，立即（单次给药的第4天为多次给药第1天）进行多次给药人体药代动力学试验。每天1次（8∶00），每次1片，连续给药21 d。多次给药第21天 （试验的第24天）受试者禁食12 h后，早晨空腹给药，给药后4 h进统一食谱的标准餐。多次给药第19天、第20天的采血点为受试者的谷浓度点，即19、20 d。达稳态后，多次给药第21天给药前（0 h）和给药后 10、20、30、45 min，1、1．5、2、2．5、3、4、6、9、14、24、36、48、72 h分别采集静脉血5 mL，离心5min（4000r·min-1），分离血浆，置-80℃保存待测。

用LC-MS/MS法测定血浆中炔雌醇的浓度，采用DAS 2．0软件计算主要的药代动力学参数。

3 结 果

3.1 特异性考察

炔雌醇和内标的保留时间分别为4．28 min和1．74 min，无杂峰干扰测定，色谱图见图2。

图2 炔雌醇色谱图

3.2 标准曲线制备及定量下限

配制含炔雌醇浓度分别为1．059、3．176、10．59、31．76、63．52、127．0、211．7 pg·mL-1的标准含药血浆各1 mL，在每支标准含药血浆离心管中精密加入内标溶液（5．210 μg·mL-1）20 μL，旋涡混匀，按“2．3”项下方法操作后进行分析，计算炔雌醇丹酰氯衍生物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值f（f=As/Ai）。以峰面积比值f分别对炔雌醇的血药浓度c作权重回归计算，得炔雌醇的回归方程：f=0．00516c+0．00148，r=0．9985，权重系数w=1/c2。结果显示，炔雌醇的血药浓度在1．059～211．7 pg·mL-1范围内线性关系良好，最低定量限为1．059 pg·mL-1，信噪比为48。

3.3 精密度与准确度试验

在定量下限，低、中、高质控样品（含炔雌醇浓度分别为1．059、2．647、21．17、169．4 pg·mL-1的标准含药血浆）4个浓度水平，采用3个分析批，每批每个浓度5份样品，对该方法进行准确度与批内和批间精密度考察，结果见表2。炔雌醇的准确度与批内和批间精密度符合生物样品分析要求。

3.4 提取回收率与基质效应

按文献报道的方法[7]，配制并处理炔雌醇浓度分别为2．647、21．17、169．4 pg·mL-1的标准含药血浆，考察提取回收率和基质效应（ME）。测定得血浆中内标的回收率为 （88．2±1．8）%，ME为 （97．3± 2．6）%，血浆中炔雌醇和内标的回收率及ME见表2。结果表明，本实验条件下炔雌醇和内标的回收率均良好，血浆基质对其离子化及测定无影响。

表2 血浆中炔雌醇LC-MS/MS测定方法的精密度、准确度、回收率和基质效应（±s，n=5）

表2 血浆中炔雌醇LC-MS/MS测定方法的精密度、准确度、回收率和基质效应（±s，n=5）

质量浓度/ pg·mL-1RSD/%批内批间准确度/ %提取回收率/ %基质效应/ % 1．059 9．6 10．1 98．6±10．8 --2．647 8．3 5．0 107．5±3．0 72．0±6．0 100．4±3．1 21．17 4．5 4．1 96．7±3．1 70．4±3．9 95．8±1．2 169．4 3．5 7．1 91．8±2．4 69．3±2．7 97．2±4．6

3.5 稳定性考察

配制炔雌醇浓度分别为2．647、169．4 pg·mL-1的标准含药血浆若干份，其中3份按“2．3”项下方法处理后，立即测定；另取3份室温放置8 h、3份反复冻融3次及-20℃冰冻放置78d，考察血浆样品稳定性；同时考察血浆样品提取后的残渣于室温放置6 h及-20℃冰冻放置75 h，血浆样品提取并衍生化后的炔雌醇丹酰氯衍生物于进样器15℃放置18 h及室温放置8 h的稳定性。结果显示，炔雌醇各考察项稳定性良好，炔雌醇丹酰氯衍生物室温放置8h稳定。

本实验考察了不同pH衍生化条件下，炔雌醇丹酰氯衍生物的室温放置稳定性，结果表明不同pH衍生化条件下，炔雌醇丹酰氯衍生物在室温中均有不同程度的降解，pH为10．5时炔雌醇丹酰氯衍生物最稳定，为最适衍生化pH值。

3.6 药动学研究

12名中国健康女性受试者单次和连续21 d口服左炔诺孕酮炔雌醇片 （每片含0．02 mg炔雌醇和0．1 mg左炔诺孕酮）后炔雌醇的平均血药浓度-时间曲线见图3。本文首次报道了中国健康女性受试者在单次和连续21 d口服左炔诺孕酮炔雌醇片后炔雌醇的药动学参数，cmax、tmax和AUC的结果见表3；t1/2分别为 （12．36±4．42）h和 （15．44±3．81）h，MRT0-72分别为（12．2±3．2）h和（17．3±3．2）h，Cl/F分别为（37．67±16．17）L·h-1和（23．15±14．37）L·h-1，Vd/ F分别为（609．6±174．8）L和（408．7±94．2）L。将第19天、第20天和第21天的三组谷浓度点进行单因素方差分析，结果表明在给药第21天时炔雌醇已达到稳态血药浓度。将本研究获得的炔雌醇的主要药动学参数与国外已上市同品种、同剂量的左炔诺孕酮炔雌醇片Alesse誖和Levlite誖的主要药动学参数进行比较（见表3），结果表明中国女性受试者口服左炔诺孕酮炔雌醇片后，体内炔雌醇的药动学参数与国外女性受试者基本一致。

4 讨 论

血浆样品中炔雌醇经过提取后的残渣在碱性条件下进行衍生化后形成磺酰酯结构，经过衍生化时间和温度的考察，结果表明，炔雌醇与丹酰氯丙酮溶液在60℃反应6min时产率最高。但是磺酰酯结构在碱性条件下会发生水解，因此本实验考察了文献报道的不同pH衍生化条件下炔雌醇丹酰氯衍生物室温放置的稳定性。结果表明，炔雌醇丹酰氯衍生物在室温中均有不同程度的降解，且pH为10．5时炔雌醇丹酰氯衍生物最稳定，为最适宜衍生化pH值。

图3 12名中国健康女性受试者单次和连续21 d口服左炔诺孕酮炔雌醇片后炔雌醇的平均血药浓度-时间曲线

表3 本研究与Alesse誖、Levlite誖的炔雌醇主要药动学参数比较

[1]FDA,Available at:www．a ccessdata．fda．gov/drugsatf-da_docs/label/2008/020683s004s006s007lbl．pdf

[2]Back D,Breckenridge A,Crawford FE,et al．An in-vestigation of the pharmacokinetics of ethynylestsadiol in women using badioimmunoassay[J]．Contraception, 1979,20(3):263-73．

[3]Stanczyk FZ,Clarke NJ．Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones[J]．J Steroid Biochem,2010,121(3-5):491-5．

[4]Lima DLD,Silva CP,Otero M,et al．Low cost method-ology for estrogens monitoring in water samples using dispersive liquid-liquid microextraction and HPLC with fluorescence detection[J]．Talanta,2013,115(1):980-5．

[5]Twaddle NC,Churchwell MI,Newbold RR,et al．De-termination using liquid-chromatography-electrospray tandem mass spectroscopy ofethinylestradiolserum pharmacokinetics in adult Sprague-Dawley rats[J]．J Chromatogr B,2003,793(2):309-15．

[6]刘笑芬，丁存刚，葛庆华，等．柱前衍生，LC-MS/MS同时测定血浆中的孕二烯酮，依托孕烯和炔雌醇[J]．药学学报，2010，45（1）：87-92．

[7]刘荷英，储 妍，于 勇，等．LC-MS/MS法同时测定人尿液中5-氟尿嘧啶和吉美嘧啶浓度及其尿药排泄研究[J]．药学与临床研究，2010，18（3）：256-9．

A Sensitive Derivatization Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry Method for the Determination of the Trace Amount of Ethinyl Estradiol in Human Plasma:Method Development and Its Application in a Pharmacokinetic Study

XIN Xiao-fei,WU Yan,HE Yan-na,DING Li*
Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:An pre-column derivatization liquid chromatography-tandem mass spectrometry method (LC-MS/MS)for the determination of trace amount of ethinyl estradiol (EE)in human plasma was developed．The method was validated and applied to a pharmacokinetics study in healthy Chinese female volunteers after oral administration of the combination tablets containing 0．02 mg EE and 0．1 mg lev-onorgestrel (LNG)．Methods:The plasma sample was extracted with a mixture of cyclohexane and diethyl ether(7∶1,v/v)．The extract was dried and derived with dansyl chloride at 60℃for 6 min in a buffer solution of pH 10．5,and then analyzed by the developed LC-MS/MS method．Chromatographic separation was per-formed on an Hedera ODS-2 (150 mm×2．1 mm,5 μm)column with a gradient elution system of water con-taining 0．1%acetic acid-methanol(13∶87)．An electrospray ionization source was applied and performed in positive ion mode．The ion transitions recorded in multiple reaction monitoring mode were m/z 530．2→171．1 for derived EE and m/z 430．1→372．2 for internal standard,respectively．Results and Conclusion:The calibration curves were linear over the concentration range of 1．059～211．7 pg·mL-1．After single and multiple doses,cmaxof EE were(58．1±25．1)and(76．5±19．7)pg·mL-1,tmaxof EE were(1．8±0．6)and(1．9±0．9)h,AUC of EE were(611±223)and(762±189)pg·h·mL-1,t1/2of EE were(12．36±4．42)and(15．44±3．81)h,respec-tively．The pharmacokinetic characteristics of EE in Chinese female were reported for the first time．

Pre-column derivatization;Ethinyl estradiol;Dansyl chloride;LC-MS/MS;Pharmacokinetics

R969.1

A

1673-7806（2015）03-259-04

辛晓斐，女，硕士生 E-mail:xxf492070131@126.com

*通讯作者丁黎，男，博士生导师，教授 E-mail:dinglidl@sina.com

2015-01-12

2015-01-30