贾少坤　王　雁　隋爱华(青岛大学附属医院神经内科，山东　青岛　266003)

NINJ2基因多态性与血管性认知功能障碍的相关性

贾少坤王雁隋爱华1
(青岛大学附属医院神经内科，山东青岛266003)

〔摘要〕目的探讨神经损伤诱导蛋白(NINJ2)基因rs11833579、rs12425791位点多态性与血管性认知功能障碍(VCI)遗传易感性的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对112例VCI患者(VCI组)、108例脑梗死后无认知功能障碍患者(NCI组) 及113例健康者(对照组)的NINJ2 rs11833579、rs12425791位点进行基因型检测，比较基因型和等位基因频率在各组是否存在差异并进行关联性分析。结果①rs11833579位点:三组间基因型、等位基因分布差异均无统计学意义(χ2= 1.942，P＞0.05;χ2= 1.343，P＞0.05) ;多元Logistic回归校正危险因素后，VCI组及NCI组AA+AG基因型对患病风险无明显影响。②rs12425791位点:三组基因型、等位基因分布差异有统计学意义(χ2= 27.036，P＜0.05;χ2=19.816，P＜0.05) ;多元Logistic回归校正危险因素后，VCI组及NCI组AA+AG基因型与VCI、脑梗死的发病呈相关关系(OR= 1.785，95％CI 1.008～3.159，P＜0.05; OR= 1.864，95％CI 1.061～3.274，P＜0.05)。结论NINJ2 rs12425791基因多态性与VCI、脑梗死发病显著相关。NINJ2 rs12425791可能是VCI、脑梗死的共同易感基因。

〔关键词〕血管性认知功能障碍; NINJ2基因;脑梗死;多态性;单核苷酸

1青岛大学附属医院中心实验室

第一作者:贾少坤(1988-)，女，在读硕士，主要从事脑血管病研究。

遗传因素在血管性认知功能障碍(VCI)的发病中发挥重要作用，APOEε4〔1〕、MTHFR〔2〕已被证实与VCI的发病有关。近年来，全基因关联组研究(GWAS)成为筛选疾病易感基因的有效工具。2009年，一项全基因组关联研究发现神经损伤诱导蛋白NINJ2上游位点rs12425791、rs11833579与白种人群缺血性脑卒中有关联〔3〕，随后，国内外研究发现，NINJ2与缺血性脑卒中、阿尔茨海默病(AD)的发病有关〔4～6〕。缺血性脑卒中是VCI发生的重要病因，脑梗死和VCI有着共同的致病因素。本文探讨神经损伤诱导蛋白NINJ2基因与VCI易感性的相关性。

1　资料和方法

1.1研究对象选择2012年12月至2014年1月青岛大学医学院附属医院神经内科脑梗死患者220例(包括无认知功能障碍患者108例，VCI患者112例)及同期健康体检者113例。220例脑梗死患者诊断参照中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010〔7〕，全部患者经头部CT或MRI证实有梗死灶并按照TOAST标准进行分型〔8〕。本实验脑梗死患者仅纳入大动脉粥样硬化型。所有研究对象由2名以上神经内科医师应用简易精神状态检查量表(MMSE)〔9，10〕、临床痴呆评定量表(CDR)〔11〕及Hachinski缺血指数〔12〕评估并分组。

1.2诊断及排除标准(1) VCI组112例，男58例，女54例，平均年龄(69.49±6.371)岁。VCI诊断参照2011年脑血管认知障碍诊治指南〔13〕，并参照文献〔14～16〕制定标准如下: MMSE评分≤24分，CDR评分≥0.5分，Hachinski缺血指数≥7分。(2)无认知功能障碍脑梗死组(NCI组) 108例，男53例，女55例，平均年龄(68.43±5.789)岁。全部患者经头部CT或MRI证实有梗死灶，MMSE评分正常。(3)体检健康者(对照组) 113例，男61例，女52例，平均年龄(68.11±5.992)岁。其临床及影像学检查无脑血管病病灶及脑血管病史，MMSE评分正常。(4)排除标准:所有研究对象须排除心源性脑梗死、脑静脉窦血栓形成、动脉炎等其他病因或不明原因脑梗死、非脑血管因素认知功能损害(脑炎、AD、路易体痴呆)、心房颤动、肝肾功能不全、既往精神疾病病史、癌症等。

1.3基因组DNA的提取收取研究对象5 ml清晨空腹外周血于EDTA抗凝管，血浆离心分离后－80℃保存。采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取。

1.4NINJ2基因型检测应用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(PCR-RFLP)进行SNP位点基因型测定。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR扩增及扩增产物的酶切严格按照说明书操作。各位点引物序列、限制性内切酶及酶切片段: rs11833579正义链: GTAGAGGCAGGAGGTCACTTG，反义链: TCCCTCTATTCAGCCAGATGTA;限制性内切酶: FokⅠ;酶切产物: AA: 390 bp; GG: 291、99 bp; AG: 390、291、99 bp。rs12425791正义链: TCTCCTTCATACTGTTGACCTT，反义链: TTGTCAGAGGAGAAACCAAGTAC;限制性内切酶: Sca I;酶切产物: GG: 185 bp; AA: 144、41 bp; AG: 185、144、41 bp，电泳及测序图见图1、图2。

1.5统计学方法采用SPSS21.0统计学软件进行单因素方差分析或χ2检验。基因计数法统计各组基因型和等位基因频率，经Hardy-Weinberg平衡检验后，采用χ2检验比较各组基因型频率和等位基因频率差异，采用多元Logistic回归分析计算相对危险度(OR)及95％可信区间(CI)。

2　结果

2.1各组一般资料比较两组高血压史、糖尿病史，低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平有统计学差异(P＜0.05)。三组性别、年龄、吸烟比例及甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平均无差异(P＞0.05)。见表1。

图1　rs11833579位点、PCR-RFLP结果及片段基因测序图

图2　rs12425791位点PCR-RFLP结果及片段基因测序图

表1　各组研究对象一般资料比较(±s)

与对照组比较: 1) P＜0.05;与NCI组比较: 2) P＜0.05

VCI组(n=112) NCI组(n=108)对照组(n=113) 男/女(n)　58/54　53/55　61/52年龄(岁)　 69.49±6.371　 68.43±5.789　 68.11±5.992高血压〔n(％)〕　100(89.2)1)　90(83.3)1)　70(62.0)糖尿病病史〔n(％)〕　28(25.0)1)　30(27.8)1)　22(19.4)吸烟〔n(％)〕　40(35.7)　 54(50.0)　 40(35.4) TG(mmol/L)　 1.72±0.522　 1.64±0.524　 1.58±0.571 TC(mmol/L)　 4.54±0.765　 4.49±0.754　 4.46±0.745 HDL(mmol/L)　 1.04±0.2111) 2)1.07±0.1951)　1.13±0.225 7 LDL(mmol/L)　 2.88±0.7201) 2)2.68±0.6461)　2.66±0.694

2.2Hardy-Weinberg平衡检验各组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，表明本实验受试者具有群体代表性，见表2。

表2　NINJ2基因多态性的Hardy-Weinberg遗传平衡检验(n)

2.3基因型和等位基因频率比较

2.3.1rs11833579位点三组间基因型和等位基因频率无显著差异(χ2=1.942，P＞0.05;χ2=1.343，P＞0.05)，见表3。

表3　NINJ2基因rs11833579、rs12425791位点基因型及等位基因频率分布〔n(％)〕

2.3.2rs12425791位点三组间基因型频率差异有统计学意义(χ2=27.036，P＜0.05) ;与对照组相比，VCI组及NCI组基因型频率差异有统计学意义(χ2= 18.975，P＜0.05;χ2= 6.145，P＜0.05)。VCI组与NCI组比较，基因型频率差异有统计学意义(χ2=9.558，P＜0.05)。rs12425791位点，三组间等位基因频率差异有统计学意义(χ2= 19.816，P＜0.05) ;与对照组相比，VCI组及NCI组等位基因频率差异有统计学意义(χ2= 19.785，P＜0.05;χ2= 5.211，P＜0.05)。VCI组与NCI组比较，基因型频率差异显著(χ2=4.672，P＜0.05)，见表4。

2.3.3NINJ2 SNP位点相关性分析由于两位点AA基因型在各组例数较少，故合并基因型(显性模型)采用多元Logistic回归分析计算校正高血压、糖尿病、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白危险因素前、后相关性。rs11833579位点:校正危险因素前、后，VCI组及NCI组AA+AG基因型均对患病风险无明显影响。rs12425791位点:校正危险因素前，VCI组及NCI组AA+AG基因型与VCI、脑梗死的发病有相关关系(P＜0.05)。在校正危险因素后，VCI及NCI组AA+AG基因型仍与VCI、脑梗死的发病呈相关关系(P＜0.05)。见表4。

表4　NINJ2基因型校正危险因素前后各组OR值(95％ CI)

3　讨论

神经损伤诱导蛋白NINJ2基因位于人类染色体12P13，由4个外显子和3个内含子组成，编码合成神经损伤诱导蛋白2 (Ninjurin2)〔17，18〕。Ninjurin 2是一种由142个氨基酸组成的细胞间亲同种黏附分子，与同源蛋白Ninjurin 1合称为神经损伤诱导蛋白(Ninjurin)，Ninjurin蛋白与神经损伤的修复有关。NINJ2基因、rs11833579、rs12425791位于NINJ2基因5，端非编码区，通过NINJ2启动子参与Ninjurin 2的表达调控〔3〕。

目前，NINJ的基因研究热点为rs11833579、rs12425791两个位点。Ikram等〔3〕在全基因组关联研究(GWAS)中发现NINJ2上游位点rs11833579、rs12425791与白种人群缺血性脑卒中有关联，特别是动脉粥样硬化导致的缺血性脑卒中。随后，Matsushita等〔4〕在日本人群发现rs12425791位点与动脉粥样硬化型脑梗死强相关，但在欧洲血统人群中没有证实rs12425791、rs11833579与卒中发病相关〔19〕。王欣等〔5〕在中国汉族脑卒中的研究中发现rs12425791与中国汉族卒中发病呈相关关系，但未能发现rs11833579与该人群发病有显著关系。此外，Lin等〔6〕在AD、血管性痴呆(VD)和健康者对照研究中研究发现rs12425791、rs11833579多态性与AD发病风险显著性相关。

Gabrille等〔20〕提出，理想的VCI易感基因可分为2种:①与脑血管疾病有关的基因。②影响脑组织对脑血管病变发生反应(如脑血管损伤修复)的基因。为确定NINJ2基因属于哪一类易感基因，我们设立了NCI组与VCI组对比。

本研究提示NINJ2 rs12425791位点可能是VCI、无认知功能障碍脑梗死的共同遗传风险标记。遗传因素对大动脉粥样硬化型脑梗死的影响更明显〔21〕，推测遗传因素对大动脉粥样硬化型脑梗死患者组的影响程度高于Lin等〔6〕选取的小血管型脑梗死后VD患者，这种遗传背景差异可能是导致研究结果不一致的原因，还有待扩大样本后进一步论证。本文提示NINJ2 rs12425791位点可能与脑血管损伤修复有关。

NINJ2编码的神经损伤诱导蛋白Ninjurin2在中枢神经放射胶质细胞中低表达〔17，18〕。神经损伤后，NINJ2在神经远端的Schwann细胞中表达上调，受损神经轴突在神经损伤诱导蛋白亲同种抗原的黏附作用下顺Schwann细胞带生长延伸，同时，NINJ2基因所编码的神经损伤诱导蛋白可以与神经细胞黏附分子(N-CAM)、细胞黏附分子(L1)等分子相互作用，参与炎症反应〔17，18〕。NINJ2通过神经修复直接影响脑对血管疾病的反应外，此外，Ninjurin还可对脑缺血性损伤耐受性造成影响〔22〕，但其作用机制尚不清楚，仍需进一步研究。

4　参考文献

1 Chuang YF，Hayden KM，Norton MC，et al.Association between APOE epsilon4 allele and vascular dementia: The Cache County study〔J〕．Dement Geriatr Cogn Disord，2010; 29(3) : 248-53.

2 Liu H，Yang M，Li GM，et al.The MTHFR C677T polymorphism contributes to an increased risk for vascular dementia: a meta-analysis〔J〕．J Neurol Sci，2010; 294(1-2) : 74-80.

3 Ikram MA，Seshadri S，Bis JC，et al.Genomewide Association Studies of stroke〔J〕．N EngI J Med，2009; 360(17) : 1718-28．

4 Matsushita T，Umeno J，Hirakawa Y，et al．Association study of the polymorphisms on chromosome 12p13 with atherothrombotic stroke in the Japanese population〔J〕．J Hum Genet，2010; 55(7) : 473-6.

5王欣，张颖冬，张宙.NINJ2基因多态性及相关血清因子与卒中的相关性研究〔J〕．中华神经医学杂志，2010; 10(2) : 115-21.

6 Lin KP，Chen SY，Lc L，et al.Genetic polymorphisms of a novel vascular susceptibility gene，ninjurin2(NINJ2)，are associated with a decreased risk of Alzheimar＇s disease〔J〕．PLoS ONE，2001; 6(6) : 1-7.

7中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010〔J〕．中华神经科杂志，2010; 43(2) : 146-53.

8 Adams HP Jr，Bendixen BH，Kappelle LJ，et al．Classification of subtype of acute ischemic stroke.Definitions for use in a multicenter clinical trial.TOAST.Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment〔J〕．Stroke，1993; 24(1) : 35-41.

9 Folstein MF，Folstein SE，McHugh RR.＇Mini-Mental State＇.A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician〔J〕．J Psychiatr Res，1975; 12(3) : 189-98.

10 Grace J，Nadler JD，White DA，et al.Folstein vs modified Mini-Mental State Examination in geriatric stroke: stability，validity，and screening utility〔J〕．Arch Neurol，1995; 52(5) : 477-84.

11Morris JC．The Clinical Dementia Rating(CDR) : current version and scoring rules〔J〕．Neurology，1993; 43(11) : 2412-4．

12 Hachinski VC，Iliff LD，Zilhka E，et al.Cerebral blood flow in dementia 〔J〕．Arch Neurol，1975; 32(9) : 632-7.

13中华医学会神经病学分会痴呆与认知障碍学组写作组.血管性认知障碍诊治指南〔J〕．中华神经科杂志，2011; 44(2) : 142-7.

14 Seripa D，Matera MG，D＇Onofrio G，et al.Polymorphism C in the serotonin transporter gene in depression-free elderly patients with vascular dementia〔J〕．Dement Geriatr Cogn Disord，2010; 29(5) : 424-31.

15顾萍，王坚，邵加庆，等.阿托伐他汀对不同APOE基因型血管性认知障碍患者认知功能的影响〔J〕．南方医科大学学报，2010; 30 (3) : 512-4.

16 Rockwood K，Black SE，Song X，et al．Clinical and radiographic subtypes of vascular cognitive impairment in a clinic-based cohort study〔J〕．J Neurol Sci，2006; 240(1-2) : 7-14.

17Araki T，Zimonjic DB，Popescu NC，et al.Mechanism of homophilic binding mediated by ninjurin，a novel widely expressed adhesion molecule〔J〕．J Biol Chem，1997; 272(34) : 21373-80.

18 Araki T，Milbrandt J.Ninjurin2，a novel homophilic adhesion molecule，is expressed in mature sensory and enteric neurons and promotes neurite outgrowth〔J〕．J Neurosci，2000; 20(1) : 187-95.

19International Stroke Genetics Consortium，Welcome Trust Case-Control Consortium.Failure to validate association between 12p13 variants and ischemic stroke〔J〕．N Engl J Med，2010; 362(16) : 1547-50.

20 Gabrille GL，James FM，Donald TS，et al.Genetics of vascular cognitive impairment the opportunity and the challenges〔J〕．Stroke，2006; 37(1) : 248-2．

21 Bevan S，Traylor M，Adib-Samii P，et al.Genetic heritability of ischemic stroke and the contribution of previously reported candidate gene and genomewide associations〔J〕．Stroke，2012; 43(12) : 3161-7.

22Dimou L，Sehnell L，Montani L，et al.Nogo-A.deficient mice reveal strain-dependent differences in axonal regeneration〔J〕．J Neurosci，2006; 26(21) : 5591-603.

〔2015-01-17修回〕

(编辑曹梦园)

通讯作者:王雁(1968-)，女，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事脑血管病研究。

基金项目:山东省自然科学基金(ZR2010HM021)

〔中图分类号〕R749.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4533-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.049