张秉全　禹　晶　梁　波　林佰艳　鲍红光(齐齐哈尔医学院第二附属医院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)

胆汁酸衍生物INT-767激活FXR及TGR5降低小鼠动脉粥样硬化风险

张秉全禹晶梁波林佰艳鲍红光
(齐齐哈尔医学院第二附属医院，黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的探讨胆汁酸衍生物INT-767激活FXR及TGR5及其对小鼠动脉粥样硬化风险的影响。方法选取8周龄载脂蛋白(Apo) E-/-和低密度脂蛋白(LDL) R-/-的C57BL/6J小鼠分别用含INT-767(30 mg/kg)高纯度饲料(D12079B)喂养12 w和16 w，收集样本后进行组织生化分析(主动脉窦组织生化分析)，对CD68和MCP1进行免疫荧光检测，血清样本进行快速蛋白液相色谱分析;血清胆汁酸水平通过qTRAP LC-MS/MS法检测。血清炎性细胞因子水平通过酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测。采用电泳迁移率实验(EMSA)测定核转录因子(NF) -κB与DNA的结合活性。结果INT-767可降低ApoE-/-和LDLR-/-小鼠血清胆固醇和甘油三酯水平，抑制肝CYPB1表达下调血清胆酸和去氧胆酸水平，从而抑制LDLR-/-和APOE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成、降低ApoE-/-小鼠巨噬细胞浸润和炎症水平; INT-767主要是通过激活TGR5降低巨噬细胞细胞因子表达水平。结论胆汁酸的类似物INT-767可通过双激活TGR5和FXR调控靶基因，降低和减缓动脉粥样硬化的风险。

〔关键词〕胆汁酸衍生物; INT-767;法尼醇X受体; TβR5'端编码序列;动脉粥样硬化;风险分析

第一作者:张秉全(1979-)，男，硕士，主治医师，主要从事循环系统疾病研究。

胆汁酸作为信号分子主要通过两个受体发挥作用，法尼醇X受体(FXR)和TβR5'端编码序列(TGR5)，FXR是一个核受体，可通过鹅去氧胆酸激活，主要分布于肝脏，肾脏和肠道，并控制脂肪和碳水化合物的代谢〔1〕。通过FXR特异性激动剂活化可抑制动脉粥样硬化的发展〔2〕。TGR5(也称GPBAR1或MBAR)是一种G蛋白耦联胆汁酸受体，高表达于小肠和胆囊，尤其是CD14阳性单核细胞和巨噬细胞表面，可被初级和次级胆汁酸激活，但与石胆酸(LCA)具有最高的亲和力〔3〕。TGR5介导胆汁酸代谢作用，刺激胆囊充盈，并提高胰岛素敏感性，激活免疫抑制作用〔4〕。TGR5药理活化引起的抗动脉粥样硬化作用，是通过减少巨噬细胞炎症和脂质的吸收〔5〕。已有报道一些胆汁酸及其类似物通过不同的机制引起的抗动脉粥样硬化作用〔6〕，推测可能是通过FXR和TGR5双受体激活预防了动脉粥样硬化形成。本研究使用一种新的FXR和TGR5双受体激动剂INT-767检测动脉粥样硬化斑块的形成，发现可以降低循环血脂，并通过蛋白激酶A介导核转录因子(NF) -κB失活减轻炎症反应，从而强烈减轻动脉粥样硬化形成。

1　材料与方法

1.1动物选取8周龄载脂蛋白E(ApoE) -/-和低密度脂蛋白(LDLR) -/-的C57BL/6J小鼠分别用含INT-767(30 mg/kg)高纯度饲料(D12079B)〔7〕喂养12 w和16 w，每组8只雄鼠。所有小鼠通过禁食4 h后吸入异氟醚处死并收集样本。

1.2组织生化分析对各组小鼠的主动脉窦进行组织生化分析，并对主动脉根部组织CD68和1-甲基环丙烯(MCP1)进行免疫荧光检测，并对血清样本进行快速蛋白液相色谱(FPLC)分析。血清胆汁酸水平通过qTRAPLC-MS/MS法检测。血清炎性细胞因子水平通过酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(R＆D)检测。采用电泳迁移率实验(EMSA)测定NF-κB与DNA的结合活性(Promega)。

1.3细胞处理J774.2和Raw294.7巨噬细胞采用10 μg/ml 的INT-767和cAMP依赖蛋白激酶(PKA)抑制剂(Rp-8-BrcAMPS，Santa Cruz Biotechnology)预处理1 h，然后加入100 ng/ml的脂多糖(LPS)刺激不同时间，FXR和TGR5的过表达采用Raw294.7巨噬细胞转染含有FXR或TGR5 pcDNA3重组质粒。采用G418(250 μg/ml)筛选稳定细胞株。

1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行t检验、方差分析和Newman-Keuls分析。

2　结果

2.1INT-767降低ApoE-/-和LDLR-/-小鼠血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平INT-767处理ApoE-/-小鼠组体重明显下降(图1A)。同时发现附睾，腹膜后和皮下的白色脂肪组织重量均显著减少(图1B)。与对照组相比，INT-767处理ApoE-/-小鼠显著降低血清TC和TG水平。脂蛋白分析显示TC水平降低主要是极低密度脂蛋白(VLDL)和HDL降低，而非LDL和IDL水平降低(图1C和1D)。

FXR和TGR5双重激活的降脂作用也在LDLR-/-小鼠中得到验证，结果类似于APOE-/-小鼠，INT-767减少高纯度饲料饮食诱导的LDLR-/-小鼠体重增加(图2A)，也减少高脂饮食诱导LDLR-/-的小鼠肥胖风险(图2B)。同时INT-767可以降低LDLR-/-小鼠血清TC、TG水平，脂蛋白分析表明INT-767可降低小鼠VLDL/LDL/IDL TC水平，也显著降低VLDL TG水平(图2C、图2D)。

2.2INT-767抑制肝CYP8B1表达下调血清胆酸和去氧胆酸水平对APOE-/-小鼠肝脏FXR下游基因，如CYP7A1，CYP8B1 SR-BI、ABCB4的mRNA水平进行分析以确定INT-767是否活化FXR，发现INT-767显著减少胆汁酸合成所需的酶类CYP8B1和CYP7A1 mRNA水平，同时显著升高SR-BI和ABCB4 mRNA水平(图3A)。采用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析胆汁酸循环水平发现，INT-767显著降低正常小鼠血清胆酸，脱氧胆酸和牛磺结合型代谢产物水平，而在APOE-/-小鼠肝脏中鹅去氧胆酸和牛磺结合型代谢产物水平不变或增加(图3B)。

2.3INT-767抑制LDLR-/-和APOE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成苏丹Ⅳ染色显示，与对照组小鼠比较，INT-767可显著减少小鼠动脉粥样硬化水平，动脉粥样硬化斑块量降低81％(图4) ; LDLR-/-接受16 w INT-767喂养后，动脉粥样硬化病变减少72％(图5)。

2.4INT-767降低ApoE-/-小鼠巨噬细胞浸润和炎症水平INT-767治疗可降低循环细胞因子，如IL-1β，IL-6，IL-8和IL-12水平(表1) ;显著降低ApoE-/-小鼠主动脉根部CD68阳性(图6)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)阳性的巨噬细胞水平。此外，INT-767能显著降低主动脉炎症标记物，如IL-1β，IL-6、TNFα及MCP-1的表达。同时，ApoE-/-小鼠主动脉NF-κB的活性在进行INT-767喂养后显著降低(图7)。

表1　INT-767对ApoE-/-小鼠炎症因子水平的影响(±s，ng/ml)

表1　INT-767对ApoE-/-小鼠炎症因子水平的影响(±s，ng/ml)

组别　IL-1β　 IL-6　IL-8　IL-12 Vehicle　5．2　 168．4　152．3　756．3 INT-767(30 mg/kg)　 2．1　 119．7　68．4　138．5

图1　INT-767饮食降低高脂饮食对ApoE-/-小鼠的肥胖和高脂血症表现

图2　INT-767饮食降低高脂饮食对LDLR-/-小鼠的肥胖和高脂血症表现

图3　INT-767下调APOE-/-小鼠肝CYP8B1/CYP7A1表达降低血清胆酸/去氧胆酸水平

图4　LDLR-/-小鼠主动脉纵向剖面(×10)

图5　APOE-/-小鼠主动脉纵向剖面(×10)

图6　APOE-/-小鼠主动脉根部CD68表达(×10)

2.5TGR5激活降低巨噬细胞细胞因子表达水平J774.2细胞是唯一高表达TGR5的细胞，其他巨噬细胞TGR5在单核细胞和巨噬细胞中于静息期大量表达，但并不是在所有巨噬细胞中均表达，通过分析单核细胞和巨噬细胞系，包括Raw294.7，THP-1和U937细胞的TGR5水平均较低。INT-767也可以逆转LPS对J774.2细胞表达细胞因子(TNFα和IL-1β)的促进作用，而PKA抑制剂Rp-8-Br-cAMPS (PKAI)又能逆转INT-767对细胞因子表达的抑制作用。EMSA分析显示INT-767喂食能显著降低细胞核中活化的NF-κB p50/p65复合物水平(图8)，但并不影响LPS诱导TGR5/FXR低表达细胞系Raw294.7细胞因子的表达(表2)。稳定转染TGR5或FXR后，Raw294.7细胞显示出INT-767作用下细胞因子表达量降低的作用〔TGF50 mRNA相对表达水平: TGR5－为0，TGR5+为0.65; FXR mRNA相对表达水平: FXR－为0，FXR+为0.52〕。LPS处理高表达TGR5的Raw294.7细胞TNFα表达量较对照组降低，而不影响高表达FXR的Raw294.7细胞。

表2　INT767激活TGR5降低细胞因子相对表达水平

图7　INT-767降低ApoE-/-小鼠巨噬细胞浸润和炎症水平

图8　INT-767激活TGR5降低NF-κB活化水平

3　讨论

血脂异常与慢性炎症是动脉粥样硬化的主要诱因，因此，找到能同时抑制血脂异常和炎症反应，从而降低动脉粥样硬化风险的化合物是具有重要临床价值的〔8〕。一些报道表明，胆汁酸信号通路激活可防止或减轻血脂异常和炎症反应，主要是通过胆汁酸受体TGR5和FXR〔9，10〕。

本研究证明了一个新的FXR和TGR5双重激动剂，INT-767能有效地抑制动脉粥样硬化形成，预防高脂血症，并抑制巨噬细胞中促炎性细胞因子的表达和分泌过程。INT-767除了能降低血清TC和TG水平，还能降低血清胆酸及其代谢产物(去氧胆酸，牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸)水平，可能主要是通过激活FXR受体通路，从而减少肝胆酸合成酶CYP8B1的表达。

TGR5在单核细胞和巨噬细胞中于静息期大量表达，但并不是在所有巨噬细胞中均表达，检测不同细胞发现，J774.2细胞是唯一高表达TGR5的细胞，其他巨噬细胞细胞的TGR5水平则均较低。INT-767可以逆转LPS对J774.2细胞表达细胞因子(TNFa和IL-1β)的促进作用，胆汁酸可以作为信号分子与一些细胞受体结合，如FXR和GPCR TGR5受体。

胆汁酸在肠道被吸收后分布到全身，因此采用饮食中添加的方法制作模型是可行的〔10〕。激活外围器官的TGR5和FXR有助于宿主的新陈代谢〔11〕。

NF-κB是调节细胞因子表达的重要途径〔12〕，INT-767治疗会显著降低NF-κB的活化水平，因此在抑制炎症和同时，还可以抗动脉粥状硬化斑块的形成。

4　参考文献

1 Watanabe M，Houten SM，Wang L，et al.Bile acids lower triglyceride levels via a pathway involving FXR，SHP，and SREBP-1c〔J〕．J Clin Invest，2004; 113(10) : 1408-18.

2 Hartman HB，Gardell SJ，Petucci CJ，et al.Activation of farnesoid X receptor prevents atherosclerotic lesion formation in LDLR-/-and apoE-/-mice〔J〕．J Lipid Res，2009; 50(6) : 1090-100.

3 Thomas C，Gioiello A，Noriega L，et al.TGR5-mediated bile acid sensing controls glucose homeostasis〔J〕．Cell Metab，2009; 10(3) : 167-77.

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8 Rizzo G，Passeri D，De Franco F，et al.Functional characterization of the semisynthetic bile acid derivative INT-767，a dual farnesoid X receptor and TGR5 agonist〔J〕．Mol Pharmacol，2010; 78(4) : 617-30.

9 Hambruch E，Miyazaki-Anzai S，Hahn U，et al.Synthetic farnesoid X receptor agonists induce high-density lipoprotein-mediated transhepatic cholesterol efflux in mice and monkeys and prevent atherosclerosis in cholesteryl ester transfer protein transgenic low-densitylipoprotein receptor (-/-) mice〔J〕．J Pharmacol Exp Ther，2012; 343(3) : 556-67.

10 Liu X，Miyazaki M，Flowers MT，et al.Loss of Stearoyl-CoA desaturase-1 attenuates adipocyte inflammation: effects of adipocyte-derived oleate 〔J〕．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010; 30(1) : 31-8.

11McMahan RH，Wang XX，Cheng LL，et al.Bile acid receptor activation modulates hepatic monocyte activity and improves nonalcoholic fatty liver disease〔J〕．J BiolChem，2013; 288(17) : 11761-70.

12 Chin KV，Yang WL，Ravatn R，et al.Reinventing the wheel of cyclic AMP: novel mechanisms of cAMP signaling〔J〕．Ann N Y Acad Sci，2002; 968(1) : 49-64.

〔2015-01-20修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:鲍红光(1964-)，男，主任医师，主要从事心胸外科研究。

〔中图分类号〕R541.4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4488-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.030