刘亦恒　张　寿　朱振标　沈　慧　吴多庆　丁晓莉(海口市人民医院骨科中心，海南　海口　570208)

巴戟天多糖对去卵巢大鼠核因子-κB受体激活因子配体和骨保护素表达的影响

刘亦恒张寿朱振标沈慧吴多庆丁晓莉
(海口市人民医院骨科中心，海南海口570208)

〔摘要〕目的观察巴戟天多糖对去卵巢大鼠骨组织核因子-κB受体激活因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG) mRNA表达的影响。方法

成年雌性SD大鼠30只，随机分为假手术组、模型组、巴戟天多糖组，采用摘取双侧卵巢法建立骨质疏松模型，造模2 w后开始给药，给药3个月后观察各组大鼠骨密度(BMD)，骨钙、骨磷含量，RANKL、OPG mRNA的表达水平。结果给药3个月后巴戟天多糖组能显著提高去卵巢大鼠的BMD和骨钙、磷的含量，上调OPG mRNA表达，下调RANKL mRNA表达，使RANKL/OPG值下降。结论巴戟天多糖对去卵巢所致的大鼠骨质疏松具有良好的防治作用，其机制可能与调控RANKL和OPG mRNA的表达，降低RANKL/OPG值有关。

〔关键词〕绝经后骨质疏松;巴戟天多糖;核因子-κB受体激活因子配体;骨保护素

第一作者:刘亦恒(1976-)，男，博士，副主任医师，主要从事骨质疏松、脊柱脊髓损伤研究。

绝经后骨质疏松(PMOP)是指绝经后妇女由于体内卵巢功能降低、雌激素水平下降、骨耦联过程失调、破骨细胞的骨吸收作用大于成骨细胞的骨形成所导致的骨量减少，骨脆性增加，进而易于发生骨折的代谢性骨疾病。前期实验表明，巴戟天多糖能促进成骨细胞的增殖能力和碱性磷酸酶(ALP)的活性，影响骨代谢〔1〕。本实验观察巴戟天多糖对雌性去卵巢大鼠骨密度(BMD)，骨钙、骨磷含量，核因子-κB受体激活因子配体(RANKL)和骨保护素(OPG) mRNA表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器健康雌性SD大鼠30只，3月龄，体重(270±10) g，购自海南医学院;巴戟天药材产于海南万宁; TRIzol Reagent，美国Invitrogen公司; RT及Real Time PCR试剂盒，大连生物工程有限公司; DPX-L型双能X射线骨密度仪(美国Lunar公司) ;实时荧光定量PCR仪7500型(美国ABI公司) ;酶标仪(北京六一仪器)等。

1.2方法

1.2.1巴戟天多糖的制备取200 g巴戟天干制品粉碎，烘干，过40目筛，加入10倍体积的水，煮沸1 h，滤过，再加入3倍体积的乙醇，静置12 h，收集沉淀，得巴戟天燥粗多糖;粗多糖加水复溶，用Sevag法脱蛋白(重复2次)，活性炭脱色，无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，滤过。用蒸馏水溶解沉淀物，用无水乙醇加至其浓度为85％，离心收集沉淀物，得巴戟天多糖纯品。由海南医学院药学系制备鉴定。

1.2.2去卵巢大鼠模型制备随机取20只大鼠，用2％戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉，取背侧双切口。于脊柱外侧2 cm，髂前上棘上方1.5 cm，备皮去毛，消毒后切开局部皮肤、肌肉和腹膜，轻轻将脂肪团拉开并分离，暴露卵巢，结扎卵巢下端输卵管，摘除卵巢，缝合切口。另10只大鼠只做手术切口，不去除卵巢。

1.2.3实验分组30只雌性SD大鼠分为模型组(生理盐水+去卵巢)，假手术组(生理盐水+假手术)，巴戟天多糖组(去卵巢+100 mg/kg巴戟天多糖)。术后2 w开始，巴戟天多糖组予灌胃给药，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水，共12 w。

1.2.4BMD及骨钙、骨磷测定于术后3个月，在麻醉状态下对各组大鼠用双能X射线骨密度仪的小动物测量软件测定右股骨颈的骨密度(BMD)。BMD测定后收集大鼠右侧股骨，马福炉800℃灰化，灰化后标本测定骨中钙、磷的百分含量。

1.2.5实时定量PCR检测应用Real time-PCR仪检测实验大鼠第三腰椎骨组织中RANKL和OPG mRNA表达。

1.2.5.1骨组织总RNA的提取术后3个月，取大鼠第三腰椎，剔除周围软组织，0.9％盐水冲洗，吸干水分，放入液氮中30 min，再取出置室温下5 min，重复冻融三次。加液氮在研钵中，研碎骨组织，按TRIzol试剂说明书提取总RNA，用DEPC处理水溶解。分光光度计260/280测定RNA样品浓度并进行质量鉴定，琼脂糖凝胶电泳证实总RNA的完整性。

1.2.5.2 cDNA第一链的合成取2 μg总RNA，按RT-PCR试剂盒操作手册进行操作，合成cDNA，置－70℃保存。

1.2.5.3实时定量PCR检测根据目的基因在Genbank中的已知序列，由生工生物工程有限公司设计、合成。引物序列如下，GAPDH:上游5'-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3'，下游5'-TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA-3'; OPG:上游5'-CAT CGA AAG CAC CCT GTA-3'，下游5'-CAC TCA GCC AAT TCG GTA T-3'; RANKL:上游5'-CGT ACC TGC GGA CTATCT TCA-3'，下游5'-GTT GGA CAC CTG GACGCT AA-3'。按荧光定量PCR仪操作手册添加样本，三步法进行PCR反应。扩增条件: 95℃预变性5 min ;然后95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸35 s，共循环40次。

1.3统计学方法采用SPSS15.0软件进行t检验。

2　结果

2.1巴戟天多糖对去卵巢大鼠BMD及骨钙、磷的影响与假手术组比较，模型组BMD和骨钙、磷含量均降低(P＜0.05) ;与模型组比较，巴戟天多糖组BMD和骨钙、磷含量均升高(P＜0.05)。见表1。

2.2巴戟天多糖对去卵巢大鼠RANKL和OPG mRNA表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠RANKL mRNA表达水平增高，OPG mRNA表达水平降低，RANKL/OPG值增高(P＜0.01) ;与模型组比较，巴戟天多糖组RANKL mRNA表达降低，OPG mRNA表达增高，RANKL/OPG值降低(P＜0.05)。见表2。

表1　巴戟天多糖对去卵巢大鼠BMD及骨钙、磷的影响(±s，n=10)

表1　巴戟天多糖对去卵巢大鼠BMD及骨钙、磷的影响(±s，n=10)

与假手术组比较: 1) P＜0.01，2) P＜0.05;与模型组比较: 3) P＜0.05，4) P＜0.01

组别　BMD(g/cm2)　　骨钙(％)　　骨磷(％)模型组　0.158±0.0151)　61.47±2.862)　27.64±1.212)假手术组　0.227±0.024　 64.98±1.35　 29.74±1.47巴戟天多糖组　0.219±0.0124)　64.19±1.263)　29.37±1.853)

表2　巴戟天多糖对去卵巢大鼠RANKL、OPG mRNA表达及RANKL/OPG比值的影响(±s，n=10)

表2　巴戟天多糖对去卵巢大鼠RANKL、OPG mRNA表达及RANKL/OPG比值的影响(±s，n=10)

与假手术组比较: 1) P＜0.01;与模型组比较: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

组别　RANKL　OPG　RANKL/OPG模型组　6.832±2.1441)　0.214±0.0511)　33.282±10.2921)假手术组　1.147±0.372　 1.258±0.254　 0.926±0.215巴戟天多糖组　4.413±1.2522)　0.765±0.1723)　5.215±1.4873)

3　讨论

绝经后妇女因雌激素水平急剧下降，从而导致骨代谢平衡破坏，骨量在数年内迅速丢失。据调查，PMOP患病率达18％～25％，主要表现为腰背部疼痛，身高逐渐缩短，甚至轻微的外力作用就可能发生骨折〔2，3〕。因此，如何预防PMOP一直是相关领域的研究热点。巴戟天是我国四大南药之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。现代研究证明，巴戟天含有多种化学成分，如蒽醌类、多糖类、氨基酸、烯醚萜及其苷类等，多糖类在巴戟天含量占20％左右〔4，5〕。近年来，有研究表明巴戟天能增加去卵巢小鼠子宫重量及血清雌二醇含量，具有雌激素样作用〔6〕。进一步的研究发现巴戟天多糖可以刺激体外培养的骨髓基质细胞及成骨细胞(0B)增殖〔7〕，这预示着巴戟天用于防治骨质疏松(OP)具有重要的研究意义。

BMD值是反映OP程度，预测骨折危险性的重要依据，也是诊断OP的重要指标。OP总是伴随骨总量的丢失，即是钙、磷的丧失，因此应用骨钙、骨磷含量的变化评价OP药物治疗的有效性已得到了广泛的认同。本文结果说明巴戟天多糖有促进大鼠骨矿物含量增加，提高BMD的作用。

目前对骨代谢研究发现，存在于破骨细胞前体细胞膜表面的核因子-κB受体激活因子(RANK)是前体细胞被激活和分化成破骨细胞最重要的信号通道，而成骨细胞分泌的RANKL激活该通道。同时，成骨细胞也分泌RANKL的可溶性饵受体OPG，从而与RANKL竞争性结合并阻断其与RANK的结合，起到抑制破骨细胞生成和活化作用〔8，9〕。本实验表明，巴戟天多糖能通过够降低RANKL mRNA的表达，提高OPG mRNA的表达，达到抑制破骨细胞的激活和分化作用。综上，巴戟天多糖可以增加去卵巢大鼠骨矿物质含量，提高BMD;通过调节RANKL和OPG mRNA的表达，降低RANKL/OPG值，达到抑制破骨细胞的目的，起到防治去卵巢大鼠所致OP的作用。

4　参考文献

1崔可赜，刘亦恒，张寿，等.巴戟天多糖含药血清对体外成骨细胞DKK-1表达的影响〔J〕．时珍国医国药，2012; 23(4) : 871-2.

2张亚军，刘忠厚，张鹏.绝经后骨质疏松症流行病学研究进展〔J〕．中国骨质疏松杂志，2010; 16(3) : 229-34.

3de Oliveira Ferreira N，da Silva RB，Arthuso M，et al.Prevalence of vertebral fractures and quality of life in a sample of postmenopausal Brazilian women with osteoporosis〔J〕．Arch Osteoporosis，2012; 7(1) : 101-6.

4梁丽敏，徐勇.南药巴戟天多糖的研究进展〔J〕．食品工业科技，2011; 32(8) : 478-80.

5张海龙，张庆文，张晓琦，等．南药巴戟天的代学成分〔J〕．中国天然药物，2010; 8(3) : 192-5．

6王寅，张巧艳.巴戟天雌激素样作用的实验研究〔J〕．时珍国医国药，2011; 22(3) : 527-8.

7李楠，王和鸣，郭素华，等.巴戟天多糖及其水提物对体外培养成骨细胞活性的影响〔J〕．中国组织工程研究与临床康复，2007; 11 (23) : 4570-2.

8 Anastasilakis AD，Toulis KA，Polyzos SA，et al.RANKL inhibition for the management of patients with benign metabolic bone disorders〔J〕．Exp Opin Invest Drugs，2009; 18(8) : 1085-102.

9 Wittrant Y，Theoleyre S，Couillaud S，et al.Relevance of an in vitro osteoclastogenesis system to study receptor activator of NF-κB ligand and osteoprotegerin biological activities〔J〕．Exp Cell Res，2004;293(2) :292-304．

〔2014-08-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目:海南省自然科学基金(No.811156) ;海南省卫生厅资助项目(No.琼卫2010-69) ;海口市重点科技项目(No.2011-0135)

〔中图分类号〕R274.9

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4456-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.016