毛建萍唐晓丽浦冠勤顾海洋贲瑞生石根祥

（1.苏州大学蚕桑研究所；2.苏州大学金螳螂建筑学院 215123；3.大丰市蚕桑技术指导站；4.大丰市蚕种场）

桑枝枯病病原菌培养性状测定

毛建萍1，2唐晓丽2浦冠勤1，2顾海洋3，4贲瑞生4石根祥4

（1.苏州大学蚕桑研究所；2.苏州大学金螳螂建筑学院 215123；3.大丰市蚕桑技术指导站；4.大丰市蚕种场）

江苏大丰蚕种场桑园发现一种新的桑树病害，主要为害桑树叶片和枝条，造成叶片脱落，嫩梢褐变腐烂，停止向上生长，严重影响桑树生长和桑叶产量。通过组织分离培养获得一株病原真菌，报告其病原菌的生物学特性和培养性状测定情况。

桑树 病虫害 桑枝枯病

2014年7月，江苏大丰蚕种场桑园发现一种新的桑树病害，主要为害桑树叶片和枝条，造成叶片脱落，嫩梢褐变腐烂，停止向上生长，严重影响桑树生长和桑叶产量。通过组织分离培养获得一株病原真菌，采用Koch's法则确认其为致病病原［1］，根据发病部位和发病症状，暂称为桑枝枯病。现将其病原菌的生物学特性和培养性状测定情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

桑枝枯病病原分离材料采集于大丰蚕种场发病桑园。

1.2 供试培养基［2］

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂17g，蒸馏水1000mL；

黄豆芽培养基：黄豆芽200g，葡萄糖15g，琼脂17g，蒸馏水1000mL；

桑汁培养基：桑叶200g，葡萄糖15g，琼脂17g，蒸馏水1000mL；

上述3种培养基配制后，121℃高压灭菌30min，冷却后备用。

1.3 病原菌分离培养［2］

在无菌操作条件下用刀片切取病健交界处的病组织少许，将病组织块先在70%酒精中浸泡消毒1min，然后迅速移入0.1%升汞溶液中表面消毒1.5min，最后用无菌水漂洗3次；用剪刀将消毒后的病组织剪成小块，分别置于平板培养基表面，放入25℃恒温箱中培养。待病组织上长出菌丝后，再挑取菌丝在平板培养基上纯化获得单菌落。

1.4 回接确定病原

根据Koch's法则，用无菌水将分离得到的病原菌制作成菌悬液，选取健康桑树为接种对象。用经过消毒的接种针在桑树的嫩茎部针刺伤口，然后用无菌脱脂棉蘸取菌悬液包在茎部伤口处，叶片采用摩擦接种，接种的枝条用塑料袋包裹保湿，设三组重复，另用清水接种作对照。接种于傍晚进行，次日清晨取下保湿的塑料袋，然后逐日观察接种后的发病情况。

1.5 病原菌形态特性观察

将病原菌接种于PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养，逐日观察记录其菌丝、菌落以及分生孢子的生长情况和形态特征。

1.6 不同培养基对菌丝生长的影响

选用PDA培养基、黄豆芽培养基和桑叶汁培养基制成平板培养基，将分离纯化得到的病原菌用无菌水制成菌悬液，用直径5mm的无菌滤纸碟浸入菌悬液中蘸取分生孢子，将滤纸碟稍微晾干后放入各平板培养基表面中央处，每处理重复3次，置于25℃恒温箱中培养7d，每24h用十字交叉法测量记录菌落直径并计算出三组重复的平均值，比较不同培养基对菌丝生长的影响。

1.7 不同温度对菌丝生长的影响

将预先配制的PDA培养基制成平板，待其冷却凝固后备用。用灭菌的直径5mm滤纸碟蘸取预先配制的菌悬液，放于平板培养基中央，每皿一片，培养皿用泊拉膜密封后分别放入5℃、8℃、11℃、14℃、17℃、20℃、23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃的恒温箱中培养，每区设3个重复，培养8d，每24h用十字交叉法测量记录菌落直径，取三组重复的平均值比较不同温度对菌丝生长的影响。

1.8 不同pH值对菌丝生长的影响

首先配制PDA培养基，用土豆熬煮并过滤出1000mL滤液，加入15g葡萄糖后搅拌均匀后分别量取100mL依次倒入8个烧杯中，利用pH计和磁力搅拌器，用0.1%NaOH和0.1%HCl调节其pH值，分别调整pH值至4、5、6、7、8、9、10、11，然后分别装入加有1.5g琼脂粉的三角瓶中高压灭菌。灭菌后的培养基在无菌操作下制成平板，按照前述方法接种致病真菌，每种pH处理3次重复，放入25℃恒温箱中培养7d，每24h用十字交叉法测量记录菌落直径，取三组重复平均值比较不同pH值对菌丝生长的影响。

2 结果与分析

2.1 桑枝枯病病害症状特点

初时在桑树叶片上出现黄褐色和黑褐色病斑，多在叶脉间，后病斑相互连接形成大病斑，并逐渐发黑焦枯，叶柄萎蔫，最终脱落；发病初期枝条基本正常，中后期呈水浸状，芽基部逐渐变色，呈黄褐色至黑褐色，枝条皮层褐变腐烂，顶端生长点发黑腐烂，停止向上生长［3］，见图1。

图1 桑枝枯病发病症状

2.2 病原菌分离培养及形态特征

桑枝枯病病原菌在PDA培养基上生长速度较快，菌丝体初为白色，后逐渐转变为灰色、灰黑色至黑色；菌落圆形，平坦不透明，大而疏松，呈绒毡状，边缘可见丝状菌丝；当菌丝体培养一段时间后，在菌落上能形成略突出表面的黑色小点状子实体［4］（图2），在显微镜下可见椭圆形灰色分生孢子，分生孢子单胞（图3）。

2.3 病原菌的回接结果

将从新鲜病组织中分离得到的桑枝枯病菌回接到健康桑枝上，3d后接种部位开始发病，并有蔓延之势，其发病症状特点与田间自然发病的病枝相同，清水对照处理区则不发病。将回接得到的病组织以相同方法进行病原菌的分离培养，获得的病原菌与从田间自然发病组织分离得到的病原菌形态一致，从而可以确定该真菌即为桑枝枯病的致病病原菌。

图2 桑枝枯病菌菌丝体和子实体

图3 桑枝枯病病原分生孢子

2.4 不同培养基对菌丝生长的影响

测定结果表明，病原菌在PDA、黄豆芽培养基及桑叶汁培养基上均能良好生长，但菌丝在PDA培养基上生长速度最快，培养7d后菌落直径为74.33mm，平均生长量为11.39mm／d，桑叶汁培养基次之，7d后菌落直径和平均生长量分别为70.50mm和10.92mm／d，黄豆芽培养基培养效果与桑叶汁培养基大致相同，分别为70.00mm和10.72mm／d。可见，PDA培养基作为真菌常用培养基，其物质成分确实能够满足绝大多数真菌的生长需要。

2.5 不同温度条件对菌丝生长的影响

研究结果表明：该菌在5～35℃的11个梯度温度中均能生长，但各温度梯度之间的生长情况有明显差异（见图4）。在生长温度范围内，随着温度的升高菌丝生长速度逐渐加快，在26～29℃之间达到顶峰后长速回落。长速最快的温度条件为26、29℃，培养第6天就长满了整个平板培养基（直径90mm），日平均生长量分别为16mm／d和17mm／d；在26℃之前随着温度的升高，菌丝生长速度逐渐加快，而在29℃之后，则随温度升高而菌丝生长速度趋慢，38℃条件下则菌丝不能生长（持续观察15d）。可见，该菌的可生长温度范围有明显的适宜生长曲线，最适生长温度范围为26～29℃。

图4 不同温度下桑枝枯病菌日平均生长速度

2.6 不同pH值条件对菌丝生长的影响

测定结果表明：该菌对pH值的适应范围较广，在pH值为4～11的范围内均能很好生长，最适生长pH值为6～7之间，培养一周后菌落直径为79.67mm左右，日平均生长量为11.53～11.61mm／d；pH为11时生长相对较慢，菌落直径为60.33mm，日平均生长量为8.44mm／d。如图5所示，在pH4～11的范围内，随着pH值的升高，菌丝生长速度缓慢增加，在pH接近7时长速达到最大值后又缓慢减弱，pH值大于10后日平均生长速度明显变慢，低于10.17mm／d。通过对菌落形态的观察发现，pH值为4的条件下菌落相对较薄，其他pH值间无明显差别。

图5 不同pH值下桑枝枯病菌菌丝日平均生长速度

3 小结与讨论

通过对桑枝枯病新鲜病组织的分离培养，结合Koch's法则的应用，确认分离获得的真菌为该病害的致病性病原。根据该病害的发病症状与为害特点，初步认为这是一种新的桑树病害，暂称为桑枝枯病。由于该病害在田间的发病速度快，对桑树生长和桑叶产量的影响很大，应该引起有关部门的足够重视。

病原菌培养性状的测定结果表明，该菌适于在PDA培养基上生长，并能在培养基上形成子实体和产生分生孢子。该菌的生长温度范围为5～35℃，最适生长温度范围在26～29℃之间，菌丝的这一生长特点符合其在夏季高温下发病危害的实际情况。该菌在pH值4～11范围内均能良好生长，且培养前期（2d内）菌丝生长量没有明显差异，说明该菌对生长pH值条件的适应性较强，其最适生长pH值在6～7之间。

本次试验仅对病原菌的形态特征以及生物学特性进行了初步研究，但对于该病原菌分类地位的归属和病害的发生规律以及综合防治方法等还有待进一步研究。

［1］ 方中达.植病研究法（第三版）［M］.北京：中国农业出版社，2007.

［2］ 浦冠勤毛建萍，桑枝枯菌核病病原菌生物学特性研究［J］.蚕业科学，202，28（2）：87－90.

［3］ 陆家云.植物病原真菌学［M］.北京：中国农业出版社，2001.

［4］ 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979

S888.71＋3

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2015－08－11－001