黄馨莹，朱文瑞，陈 高，吴巧凤

（浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053）

土香薷总黄酮的含量测定及体外抗氧化作用研究

黄馨莹，朱文瑞，陈 高，吴巧凤

（浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053）

采用铝盐比色法，对土香薷药材的总黄酮含量进行了研究；以VC为阳性对照，采用DPPH法、Fent on法和FRAP法，对土香薷总黄酮对DPPH自由基、羟基自由基的清除能力和对Fe2+离子的还原能力进行了研究。结果表明：土香薷总黄酮含量为52.2 mg/g。土香薷总黄酮对DPPH自由基和羟基自由基具有较好的清除能力，其清除率的IC50分别为102.14 μg/mL和26.33 μg/mL；对Fe2+离子具有较强的还原能力。土香薷总黄酮含量较高，且具有较好的抗氧化活性。

土香薷；总黄酮；含量测定；体外抗氧化

土香薷Origanum vulgare L.为唇形科牛至属植物，又名小叶薄荷、野荆芥等，全草入药[1]，其性味辛而微温，具有清热解表、理气化湿等功效；临床用于治疗伤风感冒、发热、呕吐、急性胃肠炎及腹泻等症[2]。现代研究表明，土香薷主含挥发油、黄酮类、脂肪酸及多糖等化学成分[3]，且具有解热镇痛、抗炎止泻等药理作用[2]。

黄酮类化合物为广泛存在于植物中的多酚性成分，具有较强的清除自由基能力，能抑制细胞氧化损伤[4]。土香薷的研究当前主要集中于挥发油部位[5-7]，土香薷另含槲皮素、山奈酚、木犀草素等黄酮类成分[5]，但有关土香薷总黄酮的含量及抗氧化作用研究未见报道。故本文拟采用铝盐比色法，测定土香薷总黄酮的含量，进一步考察其对DPPH自由基、OH自由基的清除能力和对Fe2+离子还原能力，评价其体外抗氧化活性，为土香薷的进一步开发研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

尤尼柯(上海)有限公司UV-2600a型紫外可见分光光度计；北京赛多利斯天平有限公司BSA124S-CW电子天平。

1.2 试药

土香薷(产地：广西，批号:131022)，购于浙江中医药大学中药饮片厂，并经本校中药资源与鉴定教研室俞冰副教授鉴定为唇形科植物土香薷的干燥地上部分；芦丁标准品(中国食品药品检定研究院，批号: 100080-200707)，1,1-二苯基-2-苦肼基(Sigma公司，批号:S44112-089)；维生素C(浙江瑞新药业股份有限公司，批号:20120333)，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 土香薷总黄酮的含量测定

2.1.1 土香薷总黄酮提取液的制备

取土香薷药材，粉碎，过40目筛，50℃烘至恒量。称取土香薷药材粗粉10.0 g，加20倍量60%乙醇溶液，于85℃加热回流提取3次，每次2 h。合并3次滤液，浓缩，提取液转移至50 mL容量瓶中，加60%的乙醇定容至刻度，得土香薷总黄酮提取液，备用。

2.1.2 标准品溶液的制备

精密称取烘至恒量的芦丁标准品9.96 mg，以60%乙醇超声溶解，转入50 mL容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为0.1992 mg/mL的芦丁标准品溶液，备用。

2.1.3 线性关系考察

根据文献[8]的方法，准确吸取标准品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇至8.0 mL，加10%NaNO3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇至刻度，摇匀，放置10 min，于510 nm处分别测定吸光度，同行试剂空白。得吸光度Y与浓度X(mg/mL)的回归方程为：Y=12.149X+0.003 4(r=0.999 4)。表明：在0.015 9～0.055 8 mg/mL浓度范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验

精密吸取标准品溶液4.0 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.1.3”操作，连续测定6次吸光度，计算得RSD为1.02%，说明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液1.0 mL，入25 mL容量瓶中，按“2.1.3”操作，分别在显色后0、5、15、30、45、60、90min时测定吸光度，计算得RSD为1.79%，说明样品在显色后1.5h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验

取同一批土香薷药材粗粉，按“2.1.1”平行制备6份供试品溶液，测定吸光度，计算得RSD为1.20%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收试验[9]

精密称取9份已知总黄酮含量的土香薷粗粉，每份1.0 g，分别精密加入总黄酮含量的80%、100%、120%的芦丁标准品各3份，按“2.1.1”制备供试品溶液，测定吸光度，由回归方程计算总黄酮含量，计算得平均回收率为99.95%（RSD=1.94%）。加样回收率试验结果见表1，如下图。

表1 加样回收率试验（n=9）Tab.1 Recovery test（n=9）

2.1.8 总黄酮的含量测定

取同一批土香薷药材粗粉，按“2.1.1”平行制备3份供试品溶液，测定吸光度，由回归方程计算得到土香薷中总黄酮含量为52.2 mg/g。

2.2 体外抗氧化能力测定

2.2.1 清除羟基自由基(·OH)能力测定

将土香薷提取液稀释成含总黄酮浓度为20、30、40、50、60、120、150 μg/mL的溶液，分别取稀释液1 mL，置具塞试管中，依次加1 mL 6 mmol/ L FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，混匀，静置10 min；再各加1 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，混匀，静置30 min，于510 nm处测定吸光度。以相同浓度的抗坏血酸(Vc)溶液作为阳性对照。按李彩霞等[9]所述方法计算出·OH清除率，并作VC和土香薷总黄酮对羟基自由基清除作用图（见图1）。

图1 VC和土香薷总黄酮对羟基自由基清除作用的结果图Fig.1 VC and Origanum vulgare L flavonoids on hydroxyl radical scavenging effect of the results of FIG.

由图1可知，在20～150 μg/mL浓度范围内，土香薷总黄酮的清除·OH能力与浓度呈正相关，土香薷总黄酮和Vc对·OH清除率的IC50分别为102.14 μg/mL和37.78 μg/mL，证明土香薷总黄酮提取液具有一定的·OH清除作用，但效果不及Vc。实验测得土香薷总黄酮清除·OH能力的IC50为102.14 μg/mL。

2.2.2 对DPPH的清除作用

将土香薷提取液稀释成含总黄酮浓度为6、12、18、24、36、40 μg/mL的浓度，各取5 mL于具塞试管中，加入等体积浓度为0.1 mmo1/L的DPPH溶液，室温避光反应30 min，同时以无水乙醇为空白，于517 nm波长处测定吸光值。以相同浓度的抗坏血酸(Vc)溶液作为阳性对照。按王晓波等[10]所述方法计算出DPPH自由基清除率。并作VC和土香薷总黄酮提取液对DPPH自由基清除作用的结果图（见图2）。

图2 VC和土香薷总黄酮对DPPH自由基清除作用的结果图Fig.2 VC and Origanum vulgare L flavonoids on DPPH radical scavenging effect of the results of FIG.

由图2的可知，在6～40 μg/mL浓度范围内，土香薷总黄酮清除DPPH能力随浓度增大而增大，呈一定的量效关系，但弱于相同浓度的Vc。当浓度为40 μg/mL时，Vc的清除率为96.33%，而土香薷总黄酮的清除率为78.44%。实验测得土香薷总黄酮清除DPPH能力的IC50为26.33 μg/mL。

2.2.3 对FRAP还原能力的作用

[11]的方法,将土香薷提取液稀释成含总黄酮浓度为10、20、50、100、125、150、200 μg/mL的浓度，分别取稀释液0.3 mL于具塞试管中，依次加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.6)和1.5 mL 1%K3Fe(CN)6溶液，50℃水浴20 min，取出快速冷却，再加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液 (TCA)，混匀后加入2.5 mL蒸馏水及0.1 mL 0.1%FeCl3溶液，充分混匀，静置10 min后，700 nm处测定其吸光度(以60%乙醇代替样品的混合液作参比溶液)，并以相应浓度的Vc作阳性对照。并作VC和土香薷总黄酮对FRAP还原能力结果图（见图3）。

由图3可知，Vc和土香薷总黄酮对Fe2+的还原能力随着浓度增大而增强，在实验浓度范内，均与浓度呈一定的量效关系。若以反应体系吸光度值Y与样品浓度X进行回归分析，可得土香薷总黄酮的回归方程为Y=0.002X+0.289 9(R=0.9951)；Vc的回归方程为Y=0.002X+0.162 6(R=0.9755)。当土香薷总黄酮浓度为125 μg/mL时，其对Fe2+的还原能力约与52 μg/mL的VC溶液相当。

图3 VC和土香薷总黄酮对FRAP还原能力的结果图VC and Origanum vulgare L flavonoids on FRAP reducing ability results in Fig.

3 讨论

3.1 Harman提出的衰老自由基学说认为，随着年龄的增长，机体器官组织的衰退性变化是由自由基的副作用引起的[12]，机体中过量的自由基会引起蛋白质变性、多糖降解、DNA链断裂、生物膜结构损伤、细胞解体乃至机体死亡[13]。本文对土香薷总黄酮进行了体外抗氧化作用研究，实验结果表明，土香薷总黄酮能有效清除·OH和DPPH·两种自由基，可增强Fe2+的还原能力，显示土香薷总黄酮有较强的体外抗氧化作用。本文研究为土香薷总黄酮体外抗氧化能力的评价提供了参考，为土香薷的进一步开发提供了依据。

3.2 项目组前期对土香薷总黄酮的最优提取工艺进行了考察[14]，在此基础上，采用铝盐比色法测定了土香薷总黄酮的含量（52.2 mg/g），显示土香薷中含有丰富的黄酮类成分，为土香薷活性成分的研究奠定了基础。

3.3 本文仅对土香薷总黄酮的体外抗氧化活性进行了研究，但其抗氧化的活性成分及作用机制有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编[M].北京:人民卫生出版社,2000:71.

[2]李俊杰,李蓉涛.牛至的研究现状[J].光谱实验室,2013,30(1):171-174.

[3]郭雨姗,王国才,王春华,等.牛至的化学成分研究[J].中国药学杂志,2012,47(14):1 109-1 113.

[4]王晓波,李金芳,王 梅,等.山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究[J].食品研究与开发,2013,34(6):9-10.

[5]LIU Hongbing,ZHENG Anmin,LIU Huili,et al.Identifiearion of Three Novel Polyphenolic Compounds,Origanine A-C,with Unique Skeleton from Origanum vulgare L.Using the Hyphenated LC-DAD-SPE-NMR/MS Methods[J].J Agric Food Chem, 2012,60(1):129-135.

[6]许 琳,钟绮萍.天然植物抗菌药物牛至油概述[J].国外畜牧学：猪与禽,2013,33(3):54-57.

[7]霍务贞,卫世杰,袁旭江,等.气相色谱-质谱联用分析茵陈与牛至挥发油的化学成分 [J].广东药学院学报,2010,26(5): 492-496.

[8]张纵圆,彭 秧.葡萄叶中总黄酮的提取工艺优化及体外抗氧化作用研究[J].中成药,2009,31(2):292-293.

[9]李彩霞,李复兴,李 鹏,等.国槐叶黄酮的抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2013,25(5):676-680.

[10]王晓波,何晓燕,王 梅,等.火龙果皮总黄酮提取与体外抗氧化作用研究[J].食品工业科技,2011,32(11):157.

[11]Wannes W A,Mhamdi B,Sriti J,et al.Antioxidant activities of the essential oils and methanol extracts from myrtle(Myrtus communis var.italica L.)leaf,stem and flower[J].Food and chemical toxicology,2010,48(5):1 362-1 370.

[12]赵保路.自由基、营养、天然抗氧化剂与衰老[J].生物物理学报,2010,26(1):2 6-30.

[13]高健美,陆国辉,李艳茹,等.天麻素通过SIRT1/PGC-1α信号通路抗叔丁基过氧化氢诱导的HL7702细胞氧化损伤[J].中药药理与临床,2014,30(4):32-35.

[14]朱文瑞,吴巧凤,宓嘉琪,等.基于遗传算法的土香薷总黄酮提取工艺优化研究 [J].浙江中医药大学学报,2014,38(10): 1 207-1 211.

Stduy on Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Origanum vulgare L.in Vitro

HUANG Xin-ying,ZHU Wen-rui,CHEN Gao,et al
(Pharmaceutical College,Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Hangzhou 310053)

Using NaNO2-Al(NO3)3colorimetric method,to establish a method for determination of total flavonoid content in Origanum vulgare L.in herbs.Using ethanol extraction method to extract total flavonoids from Origanum vulgare L.,to prepare dry extract total flavonoids,and to study on the activity of total flavonoids from Origanum vulgare L.to eliminate hydroxyl free radical(OH)and the reducing power,with Vc as positive control.The experiment result shows the total flavonoids from Origanum vulgare L was 52.2mg/g.The content of total flavonoids from Origanum vulgare L.exhibited good DPPH radical and good Fe2+reducing power.The median inhibitory concentration(IC50)of scavenging hydroxyl radical and DPPH radical were 102.14 μg/mL and 26.33 μg/mL，respectively.The antioxidant activity of total flavonoids from Origanum vulgare L.in vitro is strong.

Origanum vulgare L.;total flavonoids;determination;Antioxidant activity in vitro

R284.2

A

1008－830X(2015)06－0588－05

2015-08-05

浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划资助项目(2013R410019，2014R410031)

黄馨莹(1994-)，女，浙江义乌人，研究方向:中药活性成分研究及新药开发.

吴巧凤，教授，博士生导师，研究方向:中药活性成分研究及新药开发.E-mail:wqfyjm@sina.com