王冬，周健鹏，王晨（1.国家肿瘤临床医学研究中心/天津市肿瘤防治重点实验室/天津医科大学肿瘤医院药学部，天津 300060；.天津市药品检验所，天津 300070）

甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物作为一种新型的丙烯酸树脂，具有理化性质稳定、无毒、无刺激性、不被人体吸收等诸多优点[1-2]，可广泛用于药物制剂领域，作为缓、控释制剂的包衣材料[3-6]。其有关物质主要为甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的单体成分。为有效控制甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物的质量，本试验建立了以高效液相色谱（HPLC）法测定其中甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯两种单体成分含量的方法。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括G1314A可变波长检测器（VWD）、ChemStation色谱工作站等（美国Agilent公司）；e2695型HPLC仪，包括2489可变波长检测器、Empower色谱工作站等（美国Waters公司）；CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 药品与试剂

甲基丙烯酸对照品（批号：190011-120801）、丙烯酸乙酯对照品（批号：190018-120921）、3批甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物样品（批号：20111204、20111205、20111206）及1批甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物仿制品均由天津某制药公司提供；试剂均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（取含十二个结晶水的磷酸氢二钠8.953 g、磷酸二氢钾3.400 g，加水溶解并稀释至1000 ml，用稀磷酸调pH至2.0）（30∶70，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：202 nm；柱温：20 ℃；进样量：20 µl[7-8]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯对照品各约10 mg，置于同一100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取50 ml，精密加入水25 ml，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品约2 g，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取50 ml，精密加水25 ml，摇匀，即得。

2.2.3 空白对照溶液 精密量取50 ml甲醇置于100 ml量瓶中，精密加水25 ml，摇匀，即得。

2.3 系统适用性和专属性试验

取“2.2”项下的空白对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各适量，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可见，甲基丙烯酸峰与丙烯酸乙酯峰在该色谱条件下可有效分离，分离度大于1.5；理论板数按甲基丙烯酸峰计算不低于1000；空白对照不干扰样品中有关物质的测定。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液1、2、4、6、8、10、15 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇-水（2∶1，V/V）稀释制成质量分数分别为0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.010%、0.015%的系列溶液。分别精密量取20 μl，注入HPLC仪，记录色谱，以质量分数为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，得甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的回归方程分别为y＝127 790x－19.98 和y＝102 548x+18 975（r＝0.999 4、0.999 1）。结果表明，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯质量分数均在0.001%～0.015%范围内均与其峰面积呈良好的线性关系。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 检测限和定量限

精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液适量，采取逐步稀释法测定，按照信噪比为3计算，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯检测限均为0.1 μg/ml；按照信噪比10计算，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯定量限均为0.3 μg/ml。

2.6 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次。结果，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

2.7.1 对照品溶液 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液适量，于室温放置0、2、4、8、25 h时分别按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，甲基丙烯酸的峰面积分别为172 425、173 297、172 911、172 600、173 103，丙烯酸乙酯的峰面积分别为157 644、157 124、156 708、153 313、153 698，RSD分别为0.2%和1.3%，表明对照品溶液在25 h内质量基本稳定。

2.7.2 供试品溶液 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液（批号：20111205），精密量取适量，于室温放置0、2、4、8、22 h时分别按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，甲基丙烯酸的峰面积分别为12 110、12 087、12 165、12 125、11 970，RSD为0.6%，丙烯酸乙酯均未检出，表明供试品溶液在22 h内质量基本稳定。

2.8 重复性试验

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液（批号：20111206），共6份，分别精密量取20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯含量。结果，甲基丙烯酸含量均为0.001%，丙烯酸乙酯均未检出，两者RSD均＜2%，表明该方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取样品（批号：20111204）约2 g，精密称定，共9份，分别置于9个100 ml量瓶中，各精密加入“2.2.1”项下对照品贮备液4、4、4、5、5、5、6、6、6 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯含量，结果详见表1。

2.10 耐用性试验

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

采用不同的厂家的仪器和色谱柱进行耐用性试验，条件1：Waters e2695型HPLC仪，Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；条件2：Agilent 1100型HPLC仪，Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果，本方法的耐用性良好，详见表2。

表2 耐用性试验结果（n＝3）Tab 2 Results of durability test（n＝3）

2.1 1 样品中有关物质含量测定

分别取3批样品及1批仿制品各适量，按“2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用外标法以峰面积计算甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的含量，结果详见表3。

表3 样品中有关物质含量测定结果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of related substances in samples（n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物是一种新型肠溶水性包衣材料，目前国内外均未见到其有关物质含量检测的报道。因此，在其检测波长的选择上笔者参考了2010年版《中国药典》（二部）聚甲丙烯酸铵酯Ⅱ中有关物质检查所用的波长，最终选定202 nm作为本品有关物质检测的波长。

3.2 流动相pH的选择

由于本品的有关物质检测中涉及的组分呈酸性，因此流动相的pH对分离效果影响较明显。本试验将缓冲液pH用稀磷酸分别调制至2.0、3.0、4.0，结果pH为2.0时分离效果最佳。

3.3 杂质限度的确定

2010年版《中国药典》（二部）聚甲丙烯酸铵酯Ⅱ有关物质检测项下提及的杂质为甲基丙烯酸、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯，要求总杂质不得过0.3%。本研究中3批样品及1批仿制品的有关物质含量测定结果显示，单个杂质均小于0.005%，总杂质均小于0.01%。故初步拟定本品有关物质限度为：单个杂质不得大于0.005%，总杂质不得过0.01%。

3.4 回收率的影响因素

本研究中，甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的平均加样回收率不高，分别为86.59%和91.24%。究其原因可能是由于：首先检测波长为202 nm，属于末端紫外吸收，氧气对测定干扰较大；其次两者的定量限均为0.3 μg/ml，样品中单体杂质含量很低。但两者平均加样回收率均大于80%，仍符合杂质检测回收率的有关要求。

综上所述，本方法简单、准确、重复性好，可用于甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物中有关物质的含量测定，并可为该辅料的质量标准的建立奠定基础。本研究结果表明，该共聚物性质稳定，聚合率高，有关物质符合规定。

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