杨丽萍，凌书建，张国华，王珊(邯郸市中心医院，河北邯郸05600;河北医科大学第二医院)

α硫辛酸对阿尔茨海默病模型大鼠海马区PKA-CREB信号通路的影响

杨丽萍1，凌书建1，张国华2，王珊2
(1邯郸市中心医院，河北邯郸056001;2河北医科大学第二医院)

摘要:目的探讨α硫辛酸对Aβ1-42所致阿尔茨海默病模型大鼠海马区PKA-CREB信号通路的影响。方法24只雄性SD大鼠按随机数字表分为正常对照组、假手术组、模型组和硫辛酸组各6只。模型组和硫辛酸组采用双侧海马一次性注射Aβ1-42的方法建立AD模型。各组均采用Morris水迷宫行定位航行试验和空间探索试验，检测记忆能力(逃避潜伏期)及学习能力(跨越平台次数);采用Western blotting法检测海马组织中蛋白激酶A(PKA)Ⅱα与p-CREB蛋白。结果与模型组比较，α硫辛酸组、对照组及假手术组逃避潜伏期明显延长、跨越平台次数明显减少(P均＜0.01);海马区组织PKAⅡα、p-CREB蛋白表达明显升高(P均＜0.01)。其中α硫辛酸组海马区组织PKAⅡα、p-CREB蛋白相对表达分别为0.739±0.417和0.380±0.329，明显高于模型组0.520± 0.462、0.219±0.452，P均＜0.01。结论α硫辛酸能够明显提高AD大鼠的学习记忆和空间探索能力;其机制可能为活化PKA-CREB信号通路，提高PKAⅡα、p-CREB蛋白表达。

关键词:阿尔茨海默病;蛋白激酶A; cAMP反应元件结合蛋白;α硫辛酸;大鼠

阿尔茨海默病(AD)是目前神经退行性疾病及痴呆的最常见原因，其发病机制仍不明确。AD特征性的病理改变是在大脑皮质和海马区域的细胞外出现以β-淀粉样蛋白(Aβ)为核心的老年斑、细胞内神经原纤维缠结以及选择性的神经元缺失。α硫辛酸(α-LA)是一种独特的氧化-还原双向的氧化应激强效抑制剂，主要通过清除自由基，螯合金属离子，再生其他抗氧化剂和修复氧化损伤而发挥抗氧化作用［1］。2012年2月～2013年1月，我们观察了α硫辛酸对AD模型大鼠海马组织蛋白激酶A(PKA)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)表达的影响，探讨α硫辛酸的脑保护作用及其机制，为其临床治疗AD提供可能的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料健康雄性SD大鼠24只，4个月龄，体质量(200±34)g，由河北医科大学基础医学院动物实验中心提供，饲养于标准实验环境中，自由摄取饮食。大鼠立体定位仪(日本东京成茂科学器械研究所)，水迷宫(北京新天地公司)，红外线扫描仪(Odyssey Li-cor Gene公司)，Aβ1-42(Sigma公司)，PKA Ⅱα试剂盒(Santa公司)，p-CREB试剂盒(CS T公司)，α硫辛酸(Sigma公司)。

1.2模型制作与干预按随机数字表将24只大鼠分为正常对照组、假手术组、模型组和α硫辛酸组各6只。行水迷宫训练3天后，模型组和α硫辛酸组制作AD模型［2］: 10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠固定于脑立体定位仪上，选择双侧海马CA1区为注射靶区，于前囟向后4.5mm，中线旁开2mm处，钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针2mm，将5 μL聚集态1 μg/ μL Aβ1-42溶液缓慢注入，留针10min，使Aβ1-42充分浸润局部组织，缓慢撤针，用骨蜡封闭颅骨创口，缝合切口。正常对照组不予处理，假手术组注入等体积生理盐水。造模后24 h，α硫辛酸组腹腔注射α硫辛酸100mg/(kg·d)，正常对照组、假手术组、模型组腹腔注射等体积生理盐水，1次/d，共21天。

1.3相关指标观察

1.3.1学习记忆能力测试药物干预后各组均采用Morris水迷宫行定位航行试验和空间探索试验［2］。①定位航行试验:将大鼠面向池壁分别从四个入水点放入水中，2min内寻找到平台的时间即为逃避潜伏期。若2min内未找到平台，则用手牵引帮助其至平台上并停留10 s，其逃避潜伏期为2min。每次训练间隔60 s，连续测试5天，每天上下午各2次。②空间探索试验:测试第6天撤除平台，将大鼠从入水点放入水中，记录其2min内穿越原来平台位置的次数。

1.3.2海马组织PKAⅡα、p-CREB蛋白表达检测

采用Western blotting法。学习记忆能力测试后麻醉大鼠迅速断头取脑，分离出海马组织(冰上操作)，立即置液氮中保存。取50mg海马组织，转移到离心管中，加入裂解液500 μL，蛋白磷酸酶抑制剂混合物5 μL，采用超声匀浆器破碎组织;离心，取上清作为待分析的样品。用BCA法［3］测定蛋白浓度。取含60 μg蛋白质的样品经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转到PVDF膜，室温封闭1 h，与PKAⅡα、p-CREB抗体进行杂交，4℃过夜，用TBST洗膜3次，与二抗辣根酶标记的羊抗兔IgG和GAPDH进行杂交，避光置于摇床，室温下孵育1 h，TBST洗二抗，4次，应用Odyssey双色红外激光成像系统检测PKAⅡα和p-CREB蛋白表达。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料检验正态分布后，以珋x±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间比较用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组学习记忆能力

2.1.1定位航行试验模型组逃避潜伏期第1～5天下降不明显，余各组均有明显下降趋势。模型组逃避潜伏期明显长于正常对照组及假手术组(P＜0.01)，且随着训练天数的增加，这种差异表现得更为明显;α硫辛酸组逃避潜伏期明显短于模型组，但均高于正常对照组与假手术组(P均＜0.01);假手术组与正常对照组避潜伏期比较，差异无统计学意义(P＞0.05);见表1。

表1　各组逃避潜伏期比较(s，)

表1　各组逃避潜伏期比较(s，)

注:与假手术组及正常对照组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01。

组别　n　　第1天　　第2天　　第3天　　第4天　　第5天正常对照组　6　69.92±3.97　60.67±1.50　50.83±3.54　41.25±3.08　30.92±3.68假手术组　6　71.75±3.19　63.33±4.76　53.17±3.93　42.50±3.71　30.42±2.47模型组　6　80.67±4.48*　78.92±4.08*　77.83±3.01*　77.00±3.52*　76.08±3.94*α硫辛酸组　6　75.67±3.96* #　72.08±3.40* #　66.08±3.18* #　60.75±3.16* #　51.50±4.29*#

2.1.2空间探索试验正常对照组、假手术组、模型组、α硫辛酸组2min内跨越平台的次数分别为(16.25±3.48)次、(14.75±2.99)次、(5.88± 1.83)次和(9.54±3.09)次，模型组跨越平台的次数明显少于假手术组及正常对照组(P＜0.01)，α硫辛酸组跨越平台次数明显多于模型组，但少于少于假手术组及正常对照组(P均＜0.01)。

2.2各组海马组织PKAⅡα、p-CREB蛋白表达与正常对照组和假手术组比较，模型组海马组织PKAⅡα、p-CREB蛋白表达明显降低(P均＜0.01);与模型组比较，α硫辛酸组海马组织PKAⅡα、p-CREB蛋白表达明显增多(P均＜0.01)。见表2、图1、图2。

表2　各组海马组织PKAⅡα和p-CREB蛋白表达比较(相对表达量，)

表2　各组海马组织PKAⅡα和p-CREB蛋白表达比较(相对表达量，)

注:与正常对照组及假手术组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01。

组别　n　PKAⅡαp-CREB正常对照组6　0.910±0.263　0.523±0.526假手术组　6　0.898±0.279　0.503±0.267模型组　6　0.520±0.462*　0.219±0.452*α硫辛酸组　6　0.739±0.417* #　0.380±0.330*#

3　讨论

研究证实，Aβ沉积于细胞外所致的神经毒性作用是AD形成和发展的关键因素［3］。Aβ导致的炎症反应和氧化应激及诱发神经细胞变性和凋亡是AD患者认知机能障碍的主要原因［4］。采用Morris水迷宫行为学方法，测定各组学习记忆能力。模型组平均逃避潜伏期明显长于假手术组及正常对照组，跨越平台次数明显减少，提示大鼠出现显著的学习和记忆功能障碍。

图1　各组海马组织PKAⅡα蛋白表达

图2　各组海马组织p-CREB蛋白表达

CREB是多种蛋白激酶的磷酸化底物。因其能刺激基因转录，故又称为“转录增强因子”。PKA是

最早被确认，也是最重要的蛋白激酶。研究发现，长时性记忆需要新蛋白质的合成［5］，而PKA-CREB信号通路在新蛋白质的合成过程中发挥重要作用［6］。其中CREB的活化是学习记忆的分子标志，能够促进长时性记忆的形成［7～9］。活化的PKA能够使CREB的Ser133磷酸化，从而引起其分子构像的变化，刺激了CREB调节转录的活性，促进学习记忆基因被大量转录，并进一步影响促进与学习记忆相关的新蛋白质合成。在这些新蛋白质中包括大量与长时性记忆相关的因子，如脑源性神经营养因子、即刻早期基因产物c-Fos、神经营养因子、Bcl-2蛋白等，均参与学习记忆的形成和维持。实验证明，Aβ能够抑制腺苷酸环化酶的活化，使细胞内cAMP水平降低，致使PKA失活，最终使CREB不能磷酸化而抑制LTM的形成［10］。Takeo等［11］报道PKA抑制剂的使用可明显阻碍长期记忆的形成。本研究结果显示，模型组海马PKAⅡα及p-CREB蛋白表达水平明显低于正常对照组和假手术组，提示其海马PKACREB信号转导通路的活动受抑制，损害了大鼠的记忆学习能力。

许多学者认为，氧化应激在AD发生的过程中起重要作用，研究显示Aβ可诱导神经细胞生产氧自由基，认为Aβ的神经毒作用部分是由自由基介导的［12］。α硫辛酸是已知天然抗氧化剂中效果最强的，被誉为“万能抗氧化剂”。α硫辛酸的抗氧化性主要表现在清除活性氧自由基、螯合金属离子、再生内源性抗氧化剂及修复氧化损伤细胞等方面。Kenjiro等［13］研究发现，α硫辛酸能够在体外能抑制Aβ蛋白聚集，减少Aβ的形成，还能够使已经聚集的Aβ降解。魏文青等［14］对β淀粉样蛋白诱导的PC12细胞的研究也表明，α硫辛酸可拮抗Aβ1-42诱导的细胞损伤，对神经细胞具有一定的保护作用。对一些转基因AD模型大鼠的研究也表明，大鼠α硫辛酸干预后学习和记忆能力明显增强［15］。本研究结果显示，与模型组比较，α硫辛酸组学习记忆能力明显好于模型组，海马组织PKAⅡα、p-CREB蛋白水平表达明显高于模型组，证实α硫辛酸的神经保护作用确切，其作用可能是通过PKA-CREB信号通路的活化来实现的。

综上所述，α硫辛酸能够抑制Aβ对海马神经细胞的损害，提高AD模型大鼠的学习记忆能力。其作用机制可能是上调PKA、CREB的表达。

参考文献:

［1］Smith AR，Shenvi SV，Widlanskym，et al.Lipoic acid as a potential therapy for chronicdisease associated with oxidative stress ［J］.Currmed Chem，2004，11(9): 1135-1146.

［2］Giovannelli L，Casamenti F，Scali C，et al.Differential effects of amyloid peptides beta-(1-40)and beta-(25-35)injections into the rat nucleus basalis［J］.Neuroscience，1995，66(4): 781-792.

［3］Bayer TA，Wirths O，Majtenyik，et al.Key factors in Alzheimer'sdisease: beta-amyloid precursor protein processing，metabolism and intraneuronaltransport［J］.Brain Pathol，2003，11(1): 1-5.

［4］刘辉，陈俊抛，田时雨，等.Aβ1-40海马注射对大鼠脑内一氧化氮合酶表达的影响［J］.中华神经科杂志，2001，34(2): 92-95.

［5］Cooke SF，Bliss TV.The genetic enhancement ofmemory［J］.Cellmol Life Sci，2003，60(1): 1-5.

［6］Nguyen PV，Woo NH.Regulation of hippocampal synaptic plasticity by cyclic AMP-dependent protein kinases［J］.Neurobiology，2003，71(6): 401-437.

［7］Brightwell JJ，Smith CA，Countryman RA，et al.Hippocampal over expression ofmutant creb blocks long-term，but not short-termmemory for a socially acquired food preference［J］.Learnmem，2005，12(1): 12-17.

［8］Brightwell JJ，Smith CA，Neve RL，et al.Long-termmemory for Place learning is facilitated by expression of cAMP response element-binding protein in thedorsal hippocampus［J］.Learnmem，2007，14(3): 195-199.

［9］Countryman RA，Gold PE.Rapid forgetting of social transmission of food preferences in aged rats: Relationship to hippocampal CREB activation［J］.Learnmem，2007，14(5): 350-358.

［10］Vitolo OV，Sant-Angelo A，Costanzo V，et al.Amyloid beta-peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility bydrugs that enhance AMP signaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(20): 13217-13221.

［11］Takeo S，Niimuram，Miyake-Takagi K，et al.A possiblemechanism for improvement by a cognition-enchanter nefiracetam of spatialmemory function and cAMP-mediated signal transduction system in sustained cerebral ischaernia in rat［J］.Br J Pharmacol，2003，138(4): 642-654.

［12］Gella A，Durany N.Oxidative stress in Alzheimerdisease［J］.Cell Adhmigr，2009，3(1): 88-93.

［13］Kenjiro O，Mie H，Masahito Y.Alpha-lipoic acid exhibits antiamyloid fibrils in vitro［J］.BBRC，2006，341(4): 1046-1052.

［14］魏文青，刘晶，张艳，等.α硫辛酸对β淀粉样蛋白诱导的PC12细胞损伤的保护作用［J］.中国新药杂志，2009，18(21): 2065-2067.

［15］Farr SA，Price TO，Banks WA，et al.Effect of Alpha-lipoic acid onmemory，oxidation，and lifespan in SAMP8mice［J］.J Alzheimersdis，2012，32(2): 447-455.

·临床研究·

收稿日期:( 2014-12-29)

文章编号:1002-266X(2015)36-0029-03

文献标志码:A

中图分类号:R741

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.010