唐美君， 殷坤山， 郭华伟， 肖 强

（中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008）

茶刺蛾核型多角体病毒多角体的增殖动态与生产工艺

唐美君， 殷坤山， 郭华伟， 肖 强

（中国农业科学院茶叶研究所，杭州 310008）

为了解茶刺蛾核型多角体病毒（Iragoides fasciatanucleopolyhedrovirus IrfaNPV）的增殖特性、指导茶刺蛾病毒的生产，采用室内活体增殖法，测定了IrfaNPV多角体在茶刺蛾幼虫体内的增殖动态，并设计了工艺流程，进行了大量繁殖生产试验。结果显示，IrfaNPV多角体在虫体内的增殖动态符合Logistic曲线，饲毒后9～12 d为病毒快速增殖期。按设计的生产工艺进行病毒大量繁殖生产，虫尸中病毒多角体平均可达8.3×108PIB/头，茧中病毒多角体含量平均为6.4×108PIB/头。该工艺可用于今后茶刺蛾病毒的大量生产。

茶刺蛾； 核型多角体病毒； 增殖动态； 生产工艺

茶刺蛾核型多角体病毒（Iragoides fasciatanucleopolyhedrovirus，简称IrfaNPV）是茶园主要害虫茶奕刺蛾［Iragoides fasciata（Moore）］（俗称茶刺蛾）的优势病原天敌［1-3］。该病毒在茶刺蛾种群中自然感染率一般为20%～30%，高时可达70%以上，是控制茶刺蛾种群数量的重要生物因子［1］。该病毒的人工大量增殖是其广泛应用的基础。因此，阐明该病毒多角体的增殖动态和大量繁殖的生产工艺，对于了解茶刺蛾病毒的增殖特性、指导茶刺蛾病毒的生产，进而促进其推广应用具有重要意义。

前人的研究明确了该病毒的形态、致病力、毒性和田间应用效果［2-5］，其人工大量增殖的最优条件也有报道［6］，但该病毒多角体的增殖动态和生产工艺尚缺乏深入研究。为了更好地指导茶刺蛾病毒的生产，本文测定了IrfaNPV多角体在茶刺蛾幼虫体内的增殖动态，设计了病毒生产工艺流程，进行了大量增殖试验，现将相关结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

茶刺蛾核型多角体病毒采自浙江绍兴，通过室内感染茶刺蛾幼虫进行病毒大量增殖获得虫尸，经离心提纯后，获得病毒原液，置4℃冰箱中保存备用。

茶刺蛾幼虫，通过室内连续大量饲养获得。饲养方法同文献［6］。

1.2 IrfaNPV多角体增殖动态

从田间采集新鲜茶树叶片，在1×106PIB/mL病毒液中浸湿后晾干备用。挑取5龄幼虫置于直径15 cm的培养皿中，每培养皿30头，共600头。用上述病毒液浸渍过的叶片饲喂幼虫。在恒温箱中饲养，饲养条件：温度（24±1）℃，湿度75%左右，光周期L∥D＝12 h∥12 h。饲毒后，每隔24 h取样1次，直至幼虫死亡或化蛹。每次随机挑取幼虫40头，放在250 mL广口瓶中，置于－18℃保存，并观察记录茶刺蛾的病症和取食情况。取样结束后，统一进行病毒提纯和显微计数，方法同文献［6］。

1.3 IrfaNPV大量繁殖

首先进行茶刺蛾的大量饲养，在幼虫饲养至6龄时进行饲毒。从田间剪取新鲜茶枝，插在盛水的500 mL广口瓶中。用小喷雾器将1×106PIB/mL的病毒液均匀喷在茶枝上，待药液干后，将健康幼虫转移到茶枝上。室内温度控制在24～26℃，RH 70%～80%，自然光照。饲毒3 d后，将带虫茶枝移至养虫框（46 cm×32 cm×17 cm）中，用无病毒叶片继续饲养。幼虫开始死亡时进行病毒的收集，直至全部死亡或化蛹。每次试验供试虫600～1 000头。

收获的虫尸或茧加水浸泡后首先用组织捣碎机捣碎、过滤，滤液先经自然沉淀取上清液后再离心，方法为：将滤液倒入500 mL量筒中进行自然沉淀，分层后立即吸取上层液。在沉淀中再加入水，分层后再吸取上层液，重复3～4次，弃去沉淀。上层液用3 000 r/min离心30 min，去上清液，病毒多角体沉淀加水搅匀后再离心一次，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，获得病毒原液。采用血球板显微计测法测定多角体的数量，计算原液的多角体含量，再根据供试虫数，计算出病毒产量。

1.4 数据统计与分析

采用DPS统计软件进行增殖动态曲线的拟合，在Excel中作图。

2 结果与分析

2.1 IrfaNPV多角体的增殖动态

茶刺蛾核型多角体病毒增殖动态测定结果表明，饲毒后1～8 d IrfaNPV增殖缓慢，病毒多角体含量在1×108PIB/头以下，第9天起病毒多角体含量开始快速上升，至第12天达最高峰（3.77×108PIB/头）。病毒多角体增殖动态符合Logistic曲线（图1）。

图1 茶刺蛾核型多角体病毒的增殖动态Fig.1 The dynamic of propagation of IrfaNPV

饲养观察发现，饲毒后1～5 d内，茶刺蛾幼虫均正常取食，外表看没有异常；6～8 d时，幼虫开始不停爬动，爬行十分迅速，显得烦躁，并且取食较少；9 d后幼虫爬行减少；10 d后基本不动，并出现典型的病毒虫尸。幼虫感染病毒后症状表现与体内病毒多角体增殖动态基本吻合。

2.2 IrfaNPV大量繁殖生产工艺

以病毒多角体增殖动态的试验结果和大量繁殖的最优条件［6］为主要技术参数，参照昆虫病毒生产的一般规律［7-8］，设计了IrfaNPV生产工艺流程（图2）。整个生产工艺分为三个部分，首先是茶刺蛾幼虫的大量饲养，其中95%的饲养幼虫用于病毒繁殖，剩下的5%用于保种，繁殖下一代。第二步是IrfaNPV的大量增殖，主要技术参数为：在6龄中期饲毒，饲毒浓度1×106PIB/m L，持续饲毒时间3 d，饲养温度24℃。最后是IrfaNPV的收集与提纯，病死幼虫和茧均需收集，在常规的离心提取之前采用自然沉淀法先去除一些较大的杂质。

按照该工艺进行病毒多角体大量繁殖生产试验，幼虫虫尸的病毒产量为5.9×108～10.4×108PIB/头，平均8.3×108PIB/头（表1）。此外，部分幼虫会结茧化蛹，茧内大多数为死亡的预蛹。茧中病毒含量高低不等，最低为2.1×108PIB/头，最高则有10.2×108PIB/头，平均为6.4×108PIB/头。

图2 IrfaNPV生产工艺流程Fig.2 The production process of IrfaNPV

表1 茶刺蛾核型多角体病毒的大量繁殖生产Table 1 The trial of the mass production of IrfaNPV

3 小结与讨论

本文根据IrfaNPV的增殖特性，设计了其生产工艺。应用该工艺流程进行茶刺蛾病毒多角体的大量繁殖，死亡幼虫病毒产量高（平均8.3×108PIB/头），茧（蛹）中也含大量病毒（平均6.4×108PIB/头）。该工艺可用于茶刺蛾病毒的大量生产。

本工艺流程为病毒多角体原药的生产流程，生产获得的病毒多角体原药不需添加保护剂。后续加工可根据实际生产的剂型添加相应的助剂，如生产纯病毒水剂可添加保护剂、增稠剂等，生产病毒Bt混剂则需将病毒多角体原药添加至Bt产品中。由于病毒制剂多用于有机茶园，因此制剂中最好不添加人工合成的保护剂。病毒多角体原药通常低温冷藏（4℃左右）放置，一般可保存多年。如果加工成制剂（纯病毒水剂或病毒Bt混剂），则通常为常温放置，货架寿命为1～2年。病毒制剂的田间应用效果在88%以上［4-5］。

IrfaNPV的增殖动态符合Logistic曲线，这与一般昆虫病毒的增殖动态［8］相一致。饲毒后9～12 d为该病毒快速增殖期，此时幼虫已不大活动，取食很少，几乎停食。在病毒大量增殖过程中可否利用这一时期进行虫尸的一次性收集，以提高病毒生产的工效有待进一步研究。

一般来说，昆虫感染病毒后在末龄幼虫的中后期死亡时病毒产量最高，太早死亡或在预蛹或蛹期死亡则产量低［9］。因此过去的病毒生产中均比较注重收集虫尸，而忽略蛹的收集。本文研究结果显示，茶刺蛾茧（蛹）中也含有大量病毒多角体，这可能与茶刺蛾幼虫历期较长、在茧中以预蛹态死亡有关。因此在茶刺蛾病毒生产中除收集幼虫虫尸外也应注重茧（蛹）内病毒的收集提纯。

通常茶刺蛾健康幼虫的饲养可全年进行，病毒多角体的生产则集中在幼虫发生期内（5－11月）完成。病毒多角体的产量取决于健康幼虫的饲养总量和单头虫的病毒繁殖量。按本文提出的工艺生产，单头幼虫虫尸或茧（蛹）的病毒多角体含量分别为8.3×108、6.4×108PIB。健康幼虫的饲养总量可根据实际需要来确定。如预计来年约3 333 hm2茶园需采用病毒防治，则每批次需饲养1万头幼虫进行病毒增殖，病毒多角体总量为6.5×1012～8.5×1012PIB，全年按4个批次计算，则可生产病毒多角体原药2.6×1013～3.4×1013PIB。一般每667 m2茶园病毒多角体用量为5×108PIB，因此这些病毒多角体的量可供3 467～4 533 hm2茶园应用。

［1］ 朱俊庆.茶树害虫［M］.北京：中国农业科技出版社，1999：72.

［2］ Yang L R，Xiao Q，Zhang BQ，et al.Characterization of a baculovirus newly isolated from the tea slug moth，Iragoidae fasciata［J］.The Journal of Microbiology，2009，47（2）：208 213.

［3］ 叶恭银，胡萃，洪健，等.茶奕刺蛾核型多角体病毒形态和毒力的研究［J］.浙江农业学报，1992，4（3）：133 136.

［4］ 唐美君，肖强，郭华伟，等.茶刺蛾核型多角体病毒制剂示范应用试验［J］.中国茶叶，2007，29（3）：28 29.

［5］ 唐美君，殷坤山，郭华伟，等.茶刺蛾核型多角体病毒的毒性测定与田间应用［J］.植物保护学报，2010，37（1）：93 94.

［6］ 唐美君，殷坤山，郭华伟，等.茶刺蛾核型多角体病毒大量增殖的最优条件［J］.植物保护学报，2012，39（5）：473 474.

［7］ 秦启联，程清泉，张继红，等.昆虫病毒生物杀虫剂产业化及其展望［J］.中国生物防治学报，2012，28（2）：157 164.

［8］ 胡萃，朱俊庆，叶恭银，等.茶尺蠖［M］.上海：上海科学技术出版社，1994：100.

［9］ 吴晓晶，胡萃.茶尺蠖核型多角体病毒的大量增殖研究［J］.浙江农业大学学报，1987，13（2）：150 157.

The propagation dynamics and production process of the nucleopolyhedroviruses of the tea slug mothIragoides fasciata

Tang Meijun， Yin Kunshan， Guo Huawei， Xiao Qiang
（Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou310008，China）

To guide the production ofIragoidesfasciatanucleopolyhedrovirus（IrfaNPV），the propagation dynamic of IrfaNPV was investigated in laboratory.Meanwhile，the production process was developed and the mass production of the virus was conducted according to the process.The results showed the propagation dynamic of IrfaNPV in the larval body accorded with logistic curve.The average yield of IrfaNPV reached 8.3×108PIB/larva and 6.4×108PIB/cocoon，respectively.The process is expected to be applied in mass production of IrfaNPV in the future.

Iragoides fasciata； nucleopolyhedroviruses； propagation dynamic； production process

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.036

2014 01 21

2014 04 16

国家科技基础性工作专项（2013FY113200）；浙江省茶产业科技创新团队项目（2011R50024）

*通信作者 E-mail：tmjtea@163.com