沈亚芬，丁勤霞，宋利斌，朱曙东，沈金根

1.浙江省中医院，浙江 杭州 310000；2.桐乡市第一人民医院，浙江 桐乡 324500

夏枯草对3种肿瘤细胞抑制作用的实验研究

沈亚芬1，丁勤霞1，宋利斌1，朱曙东1，沈金根2

1.浙江省中医院，浙江 杭州 310000；2.桐乡市第一人民医院，浙江 桐乡 324500

目的：探索夏枯草粗提物对3种肿瘤细胞（淋巴瘤细胞株Jurkat、人肺癌细胞株A-549、子宫内膜癌细胞株Ishikawa）生长抑制作用，为夏枯草抗癌机制的深入研究提供实验参考依据。方法：以不同浓度的夏枯草粗提物供试液作用于3种肿瘤细胞，采用MTT法计算其IC50值，观察药物对3种肿瘤细胞的抑制作用，同时设置空白组、对照组、阳性对照组。结果：夏枯草粗提物对Jurkat细胞、A-549细胞、IShikawa细胞IC50值分别为59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，且夏枯草对3种肿瘤细胞的抑制率在一定范围内随药物浓度增加而加强。结论：夏枯草对Jurkat细胞、A-549细胞、IShikawa细胞的增殖具有一定的抑制作用，对抗癌机制的研究以及临床抗癌药物的筛选具有一定的参考价值。

夏枯草；肿瘤；细胞株；MTT法；体外增殖

夏枯草为唇形科多年生草本植物夏枯草(Prunella vulgaris L)的干燥成熟果穗[1]，性寒，味微苦、甘、辛，主入肝经、胆经，具有清火明目、散结消肿、清热活血、祛痰止咳的功效[2～4]。现代药理研究表明，夏枯草具有降血糖、抗菌消炎、抗病毒感染、调节免疫、降血压、降血脂、保肝利胆等作用[5]。此外，该药材对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6]。笔者采用MTT法研究夏枯草粗提物对3种肿瘤细胞(淋巴瘤细胞株Jurkat、肺癌细胞株A-549、子宫内膜癌细胞株Ishikawa)体外增殖的影响，为其抗癌机制的深入研究以及临床用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 淋巴瘤细胞株Jurkat、肺癌细胞株A-549购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，子宫内膜癌细胞株Ishikawa由浙江大学医学院附属妇产科医院妇科肿瘤实验室馈赠。

1.2 药品与试剂 夏枯草购自萧山医药公司。MEM培养液(HyClone公司，批号：NWL 0507)；优级胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：TBD21HY)；胰蛋白酶(0.25%Trypsin-EDTA，Gibco，批号：1023133)；DMSO(二甲基亚砜，Sigma，批号：D8370)；MTT(四甲基偶氮唑盐，Solarbio，批号：M8180)；其余试剂为分析纯；阿霉素(Solarbio，批号：P1421，规格：10 mL/支)。

1.3 仪器与设备 酶标仪(BIORAD，日本)；无菌净化工作台(苏州净化设备厂)；显微镜(Olympus IX41)；二氧化碳培养箱(NV-2500E，美国)；微量振荡器(江苏金坛市中大仪器厂)；电子天平(BP-2110，德国)。

1.4 癌细胞株的常规培养 将Jurkat细胞、A-549细胞、Ishikawa细胞置于37℃，5%CO2，湿度95%细胞培养箱培养。培养细胞生长1天后更换培养液，待细胞生长到80%～90%时，弃去培养液，以PBS磷酸盐缓冲液清洗1～2次，加1 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃下消化1 min，弃去胰蛋白酶，加入5～6 mL培养液吹打，分装至2个不同的培养瓶中，补加培养液，标记，放入培养箱培养。

1.5 夏枯草供试液的制备 对药材以水煎法提取2 h，加入乙醇，至乙醇浓度为75%，制得夏枯草粗提物，取夏枯草粗提物适量，精密称定，溶于DMSO中，用细胞培养液分别稀释配制成含生药浓度为 24.2 mg/mL，48.4 mg/mL，60.5 mg/mL，84.7 mg/mL，121.0 mg/mL的供试液。供试液中DMSO浓度控制在1%以下。

1.6 MTT比色法测定药物的抗癌活性 取对数生长期的淋巴瘤Jurkat细胞、肺癌A-549细胞、子宫内膜癌IShikawa细胞(5×104mL-1)接种于96孔培养板，每孔接种细胞悬浮液200 μL，置于37℃、湿度为95%、5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞完全贴壁后，吸出培养液。实验组：加入上述不同浓度的夏枯草供试液；阳性对照组：加入浓度分别为0.04 μg/mL，0.16 μg/mL，0.63 μg/mL，2.50 μg/mL，9.86 μg/mL的阿霉素试液；空白组：只加入细胞培养液；对照组：加入细胞培养液和癌细胞；每个浓度均为4孔，每孔加入体积为200 μL，培养48 h后，每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培养4 h后，小心吸掉孔板中的培养液，每孔加入150 μLDMSO，低速振荡10 min使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定各孔OD值，测定波长570 nm，计算细胞的生长抑制率。以上实验平行做两次，计算平均值。细胞生长抑制率(%)=(对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/ (对照孔测定的平均OD值-空白孔测定的平均OD值)× 100%。

1.7 统计学方法 所有数据均以SPSS17.0进行分析，计数资料以率或构成比表示，行χ2检验；计量资料以(±s)表示，行t检验。

2 结果

各组对肿瘤细胞增殖的抑制作用比较，见表1、表2、表3。不同浓度的供试液对3种肿瘤细胞的增殖均有一定的抑制作用，IC50值分别为59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，并且在一定范围内，夏枯草对细胞的抑制率随药物的浓度增加而加强，呈现一定的剂量依赖性。

表1 各组对Jurkat细胞增殖抑制作用比较

表2 各组对A-549细胞增殖抑制作用比较

3 讨论

癌症严重威胁着人类的生命安全，有效的抗癌药物的筛选对癌症的治疗具有重要的意义。MTT法利用外源性MTT与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并在细胞中进行沉积，而死细胞却不呈现这种现象，以此反映活细胞存在的数量。在一定的细胞数范围内，产生MTT结晶的量与活细胞数目成正比[7]。此种方法准确性高，重现性好，灵敏度高，且经济适用等优点。目前已广泛应用于抗肿瘤药物活性的筛选、一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验等[8]。实验研究表明，夏枯草对肺癌细胞、胃癌细胞SGC-7901、淋巴癌细胞Raji、食管癌Eca-109细胞等具有一定的抑制作用[9]。其中李军等[10]报道夏枯草可以有效的激活P53蛋白、抑制Bcl-2蛋白的表达，促使淋巴癌细胞Raji的凋亡。本文采用MTT法研究了夏枯草粗提物对Jurkat细胞、A-549细胞增殖的影响、同时首次研究了夏枯草粗提物对IShikawa细胞增殖生长的影响，结果显示与对照组比较，夏枯草对Jurkat、A-549、Ishikawa 3种肿瘤细胞均有一定的抑制作用，其IC50值分别为59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，且一定浓度范围内，药物对3种肿瘤细胞的抑制率呈现剂量依赖性。通过对夏枯草体外抗肿瘤细胞活性进行初步筛选，为该药材抗癌机制深入研究及临床用药奠定了基础。

表3 各组对IShikawa细胞增殖抑制作用比较

[1]梁杰康，张琳，严晓明．HPLC-ECI-MS/MS鉴定夏枯草的主要化学成分[J]．中国中医药，2013，11(14)：153-154．

[2]张明智，郑晓珂，刘宏民，等．夏枯草提取物体外诱导EL-4细胞凋亡的实验研究[J]．江苏中医药，2008，40 (4)：80-83．

[3]郑学芝，郑学海，李佳，等．夏枯草提取物对人食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响[J]．中国食物与营养，2012，18(9)：74-73．

[4]张明智，张可杰，王庆端，等．夏枯草对淋巴瘤细胞增殖的影响[J]．医药论坛杂志，2007，28(1)：54-55．

[5]许松日，金光，李文，等．夏枯草醇提取物对正常大鼠离体胸主动脉环的舒张作用[J]．四川中医，2010，28 (4)：52-53．

[6]张丽丹，苏洁，吕圭源，等．夏枯草的药理研究与临床应用[J]．海峡药学，2011，23(5)：143-145．

[7]张淼，董宝婧，苗芳，等．夏枯草提取物的抗氧化活性[J].草业科学，2012，29(9)：1477-1481．

[8]贾晓斌，封亮，陈彦，等．夏枯草肺癌化学预防物质基础研究思路与方法[J]．中草药，2009，40(2)：316-318.

[9]李艳丽．夏枯草水提物对自发性高血压大鼠降压作用的研究[J]．中外医学研究，2012，10(30)：147．

[10]李军，杨慧玲．夏枯草诱导人淋巴瘤Raji细胞凋亡及其机制[J]．中国老年学杂志，2011，31(13)：2528-2529.

（责任编辑：骆欢欢）

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R73；R285

A

0256-7415（2015）05-0273-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.05.129

2014-11-30

沈亚芬（1974-），女，主管中药师，研究方向：中药材重金属含量测定。