吴丽华, 陈燕飞, 陈 鹏

(太原师范学院 生物系,太原 030031)

硫酸锌对蚕豆根尖细胞的遗传损伤效应

吴丽华, 陈燕飞, 陈 鹏

(太原师范学院 生物系,太原 030031)

以蚕豆根尖细胞为实验材料,研究不同质量浓度的硫酸锌(ZnSO4,100～600 mg/L)对植物细胞的毒性效应.研究结果显示,在0～600 mg/L范围内,ZnSO4可诱导蚕豆根尖细胞内ROS水平升高,诱发细胞遗传损伤,使分裂指数下降、微核率增加,且随着浓度的升高毒性增强，在一定浓度范围内(0～500 mg/L),细胞微核率与处理浓度呈正相关(P<0.01).一定浓度的生育酚(VE)、抗坏血酸(AsA)或甘露醇(MT)与ZnSO4共同作用时,胞内ROS水平下降,分裂指数升高,微核率降低.研究结果提示,锌可诱导蚕豆跟腱细胞发生遗传损伤,并且与胞内ROS水平升高有关.

蚕豆;ZnSO4;微核;分裂指数;ROS

锌作为生物体的必需元素之一,是300多种酶的辅助因子[1],对维持生物正常的生长发育有着十分重要的作用．植物缺锌时可影响光合作用,导致生长发育缓慢,作物产量下降[2]．因而,市场上出现了大量含锌农药,以期提高农作物的产量．然而,高浓度的锌也会对生物造成伤害．研究表明,一定浓度的锌可引起植物细胞氧化损伤和遗传损伤[3,4]．因此,锌毒害开始受到关注．

植物根尖微核技术具有灵敏、简便、快速,并且其检测结果与动物实验具有高度一致性,已被世界多个组织采纳并广泛用于环境毒物检测中[5,6]．蚕豆根尖微核实验是常用的植物检测方法,可用来检测环境毒物的遗传毒性．本文运用蚕豆根尖微核实验,研究锌化物的遗传毒性机理,以期为研究抗逆机理提供实验依据．

1 材料与方法

1.1实验材料

选取籽粒饱满、大小一致的蚕豆种子浸种36 h后用湿纱布包裹催芽24 h．将萌发的蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中,室温条件培养;待根长约2 cm时去其根尖,促其侧根生长．

1.2材料处理

选取生长一致的蚕豆幼苗随机分组,并用质量浓度分别为100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L，500 mg/L 和600 mg/L的ZnSO4溶液培养;对照组用自来水培养;缓解组采用1 mg/L VE，1 mg/L AsA或0.1 mg/L MT分别与500 mg/L的ZnSO4同时培养．染毒12 h,换用蒸馏水培养24 h后,用于毒性实验．

1.3指标测定

1.3.1分裂指数和微核率检测

切取蚕豆根尖,用卡诺氏固定液固定24 h后,转入70%乙醇中4 ℃保存．用孚尔根法将根尖细胞染色后,切取分生区1 mm置于载玻片上,常规压片．在显微镜下直接观察并统计微核细胞、分裂细胞和分生区细胞数目．每个处理观察5个根尖, 每个根尖计数分散良好的细胞约1 000 个．微核率=微核数/观察细胞数×1 000‰,细胞有丝分裂指数=有丝分裂细胞数/观察细胞总数×100%．

1.3.2胞内ROS检测

药物处理后,取蚕豆根尖细胞于20 μmol·L-1的ROS荧光指示剂2,7-二氯荧光黄双乙酸酯(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)溶液中室温下暗孵育 30 min,用PBS洗涤后,切取根尖1～1.5 mm置于载玻片上,常规压片．在荧光显微镜下观察并拍照(激发波长488 nm)．

1.4数据分析

计算每组重复实验的平均值和标准差,F检验后,采用Duncan方法进行比较,分析处理组与对照组之间的差异显著性(*P<0.05,差异显著;**P<0.01,差异极显著)．

2 结果与分析

2.1硫酸锌对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响

硫酸锌对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响如图1所示．从图中可以看出,硫酸锌可抑制蚕豆根尖细胞有丝分裂．随着处理浓度的增高,分裂指数逐渐下降．当硫酸锌浓度为600 mg/L时,分裂指数显著降低,分裂指数为对照组的46.67%．

2.2硫酸锌对蚕豆根尖细胞微核率的影响

从图2可以看出,硫酸锌可诱导蚕豆根尖细胞微核的形成．在一定浓度范围内(0～500 mg/L),随着处理浓度的增加,细胞微核率逐渐增加,具有一定的浓度依赖性．在500 mg/L处理组中,细胞微核为20 ‰,为对照组的14.29 %,与对照组具有极显著差异;而在600 mg/L处理组中,细胞微核率有所下降,但仍显著高于对照组．

2.3抗氧化剂对硫酸锌致蚕豆根尖细胞遗传损伤的缓解作用

从图3可以看出,对照组细胞具微弱的荧光,而处理组中细胞荧光明显增强,说明硫酸锌可诱导蚕豆根尖细胞内ROS水平增高．加入1 mg/L VE,1 mg/L AsA或0.1 mg/L MT与ZnSO4同时作用时,细胞荧光强度明显弱于锌单独处理组(图3),且硫酸锌引起的遗传损伤得到明显的缓解(图4)．结果表明,硫酸锌引起细胞遗传损伤与胞内ROS水平的升高有关,即ROS参与了硫酸锌引起的遗传损伤过程．

3 讨论

锌是生物生长的必需微量元素之一,缺锌时可导致DNA受损,细胞有丝分裂受阻,机体生理功能下降[7,8]．但是,锌浓度过高同样会对机体产生不利影响．李小玲发现,锌过量与锌缺乏一样,均具有一定的胚胎毒性,能影响小鼠胚胎的生长发育,并诱发多种畸形[9]．此外,高浓度的锌可抑制生物正常生长,降低体内

抗氧化酶活性,严重时导致细胞死亡[3,4, 10-13]．本实验以蚕豆根尖细胞为材料研究了锌对植物细胞的毒性作用,结果发现,当蚕豆幼苗经高浓度锌胁迫后,根尖细胞微核率升高,分裂指数下降,即一定浓度的锌对植物细胞具有遗传毒性．

ROS是细胞在有氧代谢过程中一部分氧不能被完全还原而生成的产物,可以与细胞中各类大分子物质发生反应,从而破坏细胞结构,影响细胞的正常功能．当锌浓度过高时,蚕豆根尖细胞内ROS水平升高．外源ROS清除剂VE,ASA和MT,可以通过直接清除或间接的酶促反应来调节体内ROS水平来提高生物对环境胁迫的耐受性．当一定浓度的VE、ASA或MT与ZnSO4共同作用时,蚕豆根尖细胞内ROS水平下降,锌引起的遗传损伤毒性也得到明显的缓解．据此推测,硫酸锌对植物根尖细胞的毒性与胞内ROS水平的升高．

经锌胁迫后,胞内ROS水平显著升高,而较高浓度的ROS可激活其抗氧化系统并使细胞分裂延迟[14,15],导致细胞分裂指数下降;ROS可攻击DNA中的嘌呤、嘧啶和脱氧核糖,使DNA损伤;ROS还能影响细胞的DNA合成功能,改变DNA修复机制,使染色体发生畸变,诱导微核生成[6,14]．当锌浓度过高时,微核率下降,这是因为较高浓度的锌对细胞毒性较大,使植物根尖部分细胞发生核固缩,根尖中参与分裂的细胞数目减少;而损伤的DNA在不能分裂的细胞中无法形成微核,因此,根尖微核率降低[15]．

4 结论

本文采用蚕豆根尖细胞研究锌化物的毒性效应,发现一定浓度的锌对植物根尖细胞具有遗传毒性,可诱导蚕豆根尖细胞微核率升高,分裂指数下降,且锌对植物根尖细胞的毒性与胞内ROS水平有关．

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Genotoxicity of Zinc Sulfate on the Root Tip Cells of Vicia Faba

WU Lihua, CHEN Yanfei, CHEN Peng

(Department of Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031, China)

Zinc is an essential trace element and has important biological functions. However,excessive intake of zinc supplements is also a potential risk to humans. In this study, toxic effects of zinc on broad bean(vicia faba) were investigated either alone or in combination with some antagonists. For zinc treatment, broad bean seedling incubated in the solution containing varying amounts of zinc sulfate. For other combination treatment, selected antioxidant substances including ascorbic acid(AsA), mannitol(MT) and tocopherol(VE) were respectively added into the solution in the presence of 500 mg/L zinc sulfate. Present results showed that mitotic index(MI) decreased, but the micronuclei(MN) frequency increased significantly in vicia faba root tips after exposure to the zinc sulfate at the concentrations of 100～600 mg/L for 12 h. Moreover, zinc sulfate exposure also induced an obvious increase of intracellular ROS levels. However, when either antioxidant substances AsA (1 mg/L), MT(0.1 mg/L)or VE(1 mg/L) was used to block intracellular ROS increase,zinc sulfate-induced MN frequency significantly decreased and MI increased. These results suggested that zinc was genotoxic when the treatment concentration was higher, which is associated with an increase of the intracellular ROS levels.

vicia faba; zinc sulfata; micronuclei; mitotic index; ROS

2015-07-18

基本项目：国家自然科学基金项目(21307087);山西省高等学校大学生创新创业项目(2015363).

吴丽华(1981-),女,山西交口人,博士,太原师范学院生物系副教授,主要从事环境毒理学方面的研究.

1672-2027(2015)03-0081-04

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