孙宇，封瑞，杨磊，毛楠，胡慧媛，孙雪菲，郝丽英

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122；2.天津出入境检验检疫局工业品中心，天津 300300）

·论著·

二硫苏糖醇提取纯化Cavl.2钙通道片段CT3蛋白

孙宇1，封瑞1，杨磊2，毛楠1，胡慧媛1，孙雪菲1，郝丽英1

（1.中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳 110122；2.天津出入境检验检疫局工业品中心，天津 300300）

目的探讨二硫苏糖醇（DTT）有助于PreScission蛋白酶切除重组蛋白GST-CT3标签GST的方法。方法在大肠埃希菌BL21中转化入pGEX-6P-3/CT3重组质粒并诱导其表达，用B-PER提取纯化重组蛋白GST-CT3，在10 mmol/L DTT存在的情况下PreScission蛋白酶切除GST标签得到高浓度的CT3蛋白，进行SDS-PAGE电泳鉴定CT3蛋白。结果不含DTT情况下，PreScission蛋白酶很难切除重组蛋白GST-CT3的标签蛋白GST，而在10 mmol/L DTT存在的情况下，PreScission蛋白酶能够切除重组蛋白GST-CT3的标签蛋白GST，得到高浓度的CT3蛋白。结论10 mmol/L DTT有助于PreScission蛋白酶切除重组蛋白GST-CT3的标签蛋白GST，得到高浓度的CT3蛋白。

重组蛋白；心肌细胞；钙通道

L型钙离子通道是存在于心肌细胞上的主要钙通道。L型钙通道电流参与心肌动作电位平台期的形成与维持，钙离子（Ca2+）通过L型钙通道进入心肌细胞，从而触发钙，诱发钙释放引起兴奋收缩耦联，此过程对于心脏正常功能的发挥具有重要作用［1，2］。除此之外，L型钙离子通道还可参与可兴奋细胞神经递质的分泌、释放和自我调控转录［3，4］。心肌L型钙离子通道即Cav1.2钙通道的正常表达是心脏收缩的必要前提，Cav1.2钙通道的缺乏导致血管肌源性收缩无法正常进行，并且还可干扰激素对血压的正常调节［5］。目前研究表明心肌Cav1.2钙通道的表达与功能异常与多种疾病密切相关，例如已知的与Cav1.2钙通道相关的疾病,包括Timothy综合征、Brugada综合征、房颤、心律失常、心力衰竭等［6，7］。

心肌Cav1.2钙通道可直接或间接受磷酸化和氧化还原作用所调节［8，9］，也可被细胞内激素、蛋白激酶、磷酸化蛋白酶、钙调蛋白（calmodulin，CaM）、钙调蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ）等［8，10，11］多种细胞因子所调节，从而引起通道活性的变化，进而影响通道的功能改变。心肌Cav1.2钙通道具有较长的C末端片段，此部位是通道功能调节的重要部位，在或战或逃反应中发挥重要作用。而CT3（a.a.1942-2169）是位于Cav1.2钙通道C末端远端的片段远端羧基末端（distal carboxy terminus，DCT）的一段片段，DCT在或战或逃反应中作用关键，对Cav1.2通道的调节发挥着重要作用。有研究报道称DCT能够抑制通道活性［12～14］，然而，详细的调节机制尚不完全清楚。因此，获得DCT上的钙通道片段CT3蛋白对于钙通道相关调节机制的研究具有重要的意义。目前，实验室提取钙通道片段CT3蛋白是通过GST标签再经大肠埃希菌诱导大量表达而形成重组蛋白GST-CT3。然而与其他GST标签的蛋白相互作用时，往往需要用酶切掉标签GST而得到纯化的CT3蛋白。由于GST-CT3蛋白的特性，常规实验条件下酶无法切掉GST-CT3蛋白的标签GST。针对这一难题，本研究采用高浓度的还原剂二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）探寻酶切除GST-CT3蛋白的标签GST得到纯化的CT3蛋白的方法，为Cav1.2通道调节机制的相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达载体pGEX-6P-3和BL21菌种，购自美国Amersham Pharmacia Biotech公司；DTT、异丙基硫代半乳糖苷、氨苄西林、溶菌酶，购自日本Wako公司。丝氨酸蛋白酶、GST融合蛋白纯化凝胶（Glutathione-4B beads）、DNA酶（Turbo nuclease），购自英国GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pGEX-6P-3/CT3的诱导及表达：将重组质粒pGEX-6P-3/CT3化入BL21细菌中，在于含有0.1 mg/mL氨苄西林的LB培养液中培养，37℃水浴、100 r/min震荡过夜。将菌液用LB培养液稀释至OD 0.6～0.8范围内［15］，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，37℃水浴、100 r/min震荡5 h，诱导表达重组蛋白GST-CT3。

1.2.2 DTT提取和纯化无标签的CT3蛋白：将菌液按照6 000 r/min离心15 min，弃掉上清收集沉淀。将沉淀重悬，每克沉淀加入4 mL B-PER［16，17］、0.2 mg/mL溶菌酶、1 μL DNA酶（Turbo nuclease）和蛋白酶抑制剂，室温震荡30 min以促进细菌破膜、DNA溶解及GST-CT3蛋白的释放。16 000 r/min离心20 min，取上清置于2个15 mL EP管中，分别与PBS buffer洗过的300 μL GS-4B beeds在4℃孵育摇晃过夜。800 r/min离心弃上清，beeds分别用5 mL PBS buffer和Tris buffer各洗2次，留取少量的beeds（为GST-CT3蛋白）记为P1，取其中一管加990 μL Tris buffer和10 μL PreScission蛋白酶，标记为Control；另一管加990 μL Tris buffer、10 μL PreScission蛋白酶和终浓度为10 mmol/L DTT标记为DTT，分别4℃孵育摇晃6 h。

1.2.3 DTT提取和纯化后CT3蛋白的鉴定：将上述PreScission蛋白酶酶切后的2管蛋白分别离心留取上清10 μL记为S，分别留取少许沉淀beeds记为P2，各留取的样品经1×loading缓冲液室温处理20 min后，80℃加热5 min，进行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据Marker位置检测CT3蛋白。

2 结果

2.1 单纯酶切方法无法提取和纯化CT3蛋白

将单纯PreScission蛋白酶酶切之前的GST-CT3蛋白，即P1、PreScission蛋白酶酶切之后的上清，即S、和沉淀，即P2，分别进行12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色。如图1所示，经单纯Pre-Scission蛋白酶酶切之后，上清无任何蛋白的存在，而沉淀蛋白仍以GST-CT3蛋白形式存在。该结果证实了GST-CT3蛋白的标签GST无法被PreScission蛋白酶酶切掉。

图1 单纯酶切法无法提取出CT3蛋白Fig.1 CT3 protein could not be obtained by using enzyme alone

2.2 DTT能够提取纯化出高浓度的CT3蛋白

将PreScission蛋白酶酶切之前的GST-CT3蛋白，即P1、在10 mmol/L DTT存在的情况下经PreScission蛋白酶酶切之后的上清，即S、和沉淀，即P2，分别进行12.5%SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色。如图2所示，在10 mmol/L DTT存在的情况下经PreScission蛋白酶酶切之后，上清存在较多的CT3蛋白，而沉淀则为较多的GST蛋白和极少量的CT3蛋白，几乎不存在GST-CT3蛋白。以上结果说明10 mmol/L DTT能够有助于PreScission蛋白酶酶切GST -CT3蛋白的标签GST，且酶切效率较高。

图2 高浓度DTT能够提取出高纯度、高浓度CT3Fig.2 The CT3 protein could be obtained with high concentration of DTT

3 讨论

越来越多的研究表明，Cav1.2钙通道的DCT在通道功能调节过程中起到重要作用。有研究报道，A激酶锚定蛋白能够通过一修饰的亮氨酸拉链结合于DCT，而参与β-肾上腺素对心肌细胞Cav1.2通道的调节，从而抑制通道的活性［13］。亦有研究报道称，DCT能够与Cav1.2通道C末端近端上的CB/IQ区域直接结合从而掩盖了CaM蛋白与通道的结合位点，抑制了CaM蛋白与通道的结合因此抑制通道的活性［14］。可见，DCT在Cav1.2通道的功能调节中具有关键的作用，因此获得DCT上的钙通道片段CT3蛋白对于钙通道的研究具有重要的意义。大肠埃希菌由于其操作简单、成本低、生长快、产量高等特性常常用于重组蛋白的表达。GST标签的CT3蛋白（GST-CT3）在经大肠埃希菌诱导及表达是实验室提取纯化重组蛋白的常用方法，但由于重组蛋白结构的差异，GST-CT3蛋白的标签GST很难被PreScission蛋白酶所切掉，然而由于实验的需求，常常需要不含标签GST的单纯CT3蛋白。目前针对这一难题，有研究者提出在PreScission蛋白酶酶切过程中加入高盐、甘油等方法有助于酶切，但是效果均不理想，因此需要单纯CT3蛋白的相关实验无法开展。DTT被报道有助于重组人神经营养因子3、重组牛乳铁蛋白等多种重组蛋白的提取［18，19］，而是否能够有助于GST-CT3重组蛋白的提取目前尚无研究报道，因此本研究在重组蛋白GST-CT3应用高浓度DTT，探讨其是否能够有助于提取纯化单纯CT3蛋白。

本研究在PreScission蛋白酶酶切过程中加入高浓度DTT（10 mmol/L）。实验结果显示，与不加DTT相比，10 mmol/L DTT能够有助于PreScission蛋白酶酶切掉GST-CT3蛋白的标签GST，酶切效率很高，几乎不存在未经酶切的GST-CT3蛋白，并且提取纯化出的单纯CT3蛋白的纯度和产量均相对较高。GSTCT3重组蛋白结构的差异使其不易被PreScission蛋白酶切除标签GST，其原因可能由于在GST-CT3重组蛋白提取纯化的过程中，长期暴露于空气之中，使其被空气中的氧气氧化而引起蛋白结构的改变，掩盖或改变了PreScission蛋白酶在蛋白上的作用部位，因此PreScission蛋白酶无法发挥其正常功能。而DTT是一种可渗透过细胞膜的小分子还原剂，常常用于蛋白的提取，最近有研究报道称DTT作为还原试剂可以调控不同组织中Ca2+、Na+、KATP通道。而本实验中加入了高浓度的DTT，可以还原被空气氧化的GST-CT3重组蛋白，使其结构趋于正常，暴露出PreScission蛋白酶的作用部位。因此可以获得高浓度的单纯CT3蛋白。

综上所述，高浓度DTT方法能够提取纯化高产量、高纯度的Cav1.2钙通道片段CT3蛋白，可以广泛应用于实验研究中，为Cav1.2通道的研究奠定了基础。然而本实验仍存在不足，由于DTT（10 mmol/L）浓度较高，提取出的CT3蛋白含有较高含量的DTT，可能会对后续研究产生一定的影响，在有条件的情况下最好使用小分子渗透膜将小分子的DTT滤除，然后得到更为纯净的不含DTT的单纯CT3蛋白。

［1］Bodi I，Mikala G，Koch SE，et al.The L-type calcium channel in the heart：the beat goes on［J］.J Clin Invest，2005，115（12）：3306-3317.

［2］Oz S，Benmocha A，Sasson Y，et al.Competitive and non-competitive regulation of calcium-dependent inactivation in Cav1.2 L-typeCa2+channels by calcium and Ca2+-binding protein 1［J］.J Biol Chem，2013，288（18）：12680-12691.

［3］Jiang C，Poole-Wilson PA，Sarrel PM，et al.Effect of 17 beta-oestradiol on contraction，Ca2+current and intracellular free Ca2+in guineapig isolated cardiac myocytes［J］.Br J Pharmacol，1992，106（3）：739-745.

［4］Jarkko J，Ronkainen，Sandra L，et al.Ca2+-calmodulin-dependent protein kinaseⅡrepresses cardiac transcription of the L-type calcium channel α1C-subunit gene（Cacna1c）by DREAM translocation［J］.J Physiol，2011，589（Pt 11）：2669-2686.

［5］Monosmang S，Schulla V，Welling A，et al.Dominant role of smooth muscle L-type calcium channel Cav1.2 for blood pressure regulation［J］.EMBO J，2003，22（22）：6027-6034.

［6］Schenkel PC，Tavares AM，Fernandes RO，et al.Time course of hydrogen peroxide-thioredoxin balance and its influence on the intracellular signaling in myocardial infarction［J］.Exp Physiol，2012，97（6）：741-749.

［7］Burgoyne JR，Mongue-Din H，Eaton P，et al.Redox signaling in cardiac physiology and pathology［J］.Cirs Res，2012，111（8）：1091-1106.

［8］Wang WY，Hao LY，Minobe E，et al.CaMKⅡphosphorylates a threonine residue in the C-terminal tail of Cav1.2 Ca2+channel and modulates the interaction of the channel with calmodulin［J］.J Physiol Sci，2009，59（4）：283-290.

［9］Yang L，Xu J，Minobe E，et al.Mechanisms underlying the modulation of L-type Ca2+channel by hydrogen peroxide in guinea pig ventricular myocytes［J］.J Physiol Sci，2013，63（6）：419-426.

［10］Catterall WA.Structure and regulation of voltage-gated Ca2+channels［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2000，16：521-555.

［11］Asmara H，Minobe E，Saud ZA，et al.Interactions of calmodulin with the multiple binding sites of Cav1.2 Ca2+channel［J］.J Pharmacol Sci，2010，112（4）：397-404.

［12］Fuller MD，Fu Y，Scheuer T，et al.Differential regulation of Cav1.2 channels by cAMP-dependent protein kinase bound to A-kinase anchoring proteins 15 and 79/150［J］.J Gen Physiol，2014，143（3）：315-324.

［13］Fu Y，Westenbroek RE，Yu FH，et al.Deletion of the distal C terminus of Cav1.2 channels leads to loss of β-adrenergic regulation and heart failure in vivo［J］.J Biol Chem，2011，286（14）：12617-12626.

［14］Crump SM，Andres DA，Sievert G，et al.The cardiac L-type calcium channel distal carboxy terminus autoinhibition is regulated by calcium［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，304（3）：H455-H464.

［15］何桂林，邵冬雪，印丹丹，等.体外重组Cav1.2不同蛋白片段纯化及其与CaM相互作用的研究［J］.中国医科大学学报，2013，42（9）：773-776.

［16］封瑞，胡慧媛，郭凤，等.Cav1.2钙通道片段CT1融合蛋白的制备及生物活性鉴定［J］.中国医科大学学报，2013，42（11）：970-973.

［17］孙宇，封瑞，孙威，等.变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定［J］.中国医科大学学报，2014，43（9）：777-780.

［18］袁静明，李卓玉，王雅梅，等.利用内蛋白子剪切功能一步纯化重组人生很静营养因子-3［J］.中国生物化学与分子生物学报，2000，16（3）：335-339.

［19］林少华，罗红霞，郭慧媛，等.重组牛乳铁蛋白肽包含体的复性与纯化［J］.中国乳品工业，2006，34（1）：9-12.

（编辑 陈 姜）

Purification ofCT3 FragmentofCav1.2 with Dithiothreitol

SUN Yu1，FENG Rui1，YANG Lei2，MAO Nan1，HU Hui-yuan1，SUN Xue-fei1，HAO Li-ying1
（1.DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China；2.IndustrialGoods Center，Entry-exitInspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300300，China）

Objective To explore whetherdithiothreitol（DTT）is helpfulfor PreScission Protease to cutoffthe GST from GST-CT3 protein.MethodsThe pGEX-6P-3/CT3 recombinant plasmid was transfected into Escherichia coli BL21，and the GST-CT3 fusion protein was purified by BPER method.PreScission Protease was applied with 10 mmol/L DTT to cut off the GST，then the SDS-PAGE was performed for identification of the CT3 protein.ResultsWithout DTT，it was very difficult for PreScission Protease to cut off the GST from GST-CT3 protein.However，in the presence of10 mmol/L DTT，PreScission Protease could cutoffthe GSTeasily as identified by SDS-PAGE.Conclusion10 mmol/L DTT can help Pre-Scission Protease to cutGSTfrom GST-CT3 protein，so as to achieve high concentration ofCT3.

fusion protein；cardiac myocytes；calcium channel

R96

A

0258-4646（2015）07-0588-04

国家自然科学基金（31471091，31400981）

孙宇（1989-），女，硕士研究生.

郝丽英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2015-01-13

网络出版时间：