归国风，宋 鹏

（贵州工程应用技术学院化学化工学院，贵州毕节551700）

电致化学发光适体传感器的研究进展

归国风*，宋 鹏

（贵州工程应用技术学院化学化工学院，贵州毕节551700）

适体是一类体外筛选的RNA或DNA寡核苷酸片段，其可与目标分子高效、高特异性亲合。与抗体相比，适体具有独特的优点-耙分子范围广，适体可以与低分子量的有机或无机物质以及大分子（如酶、蛋白质）等多种目标物质进行特异性结合。该文基于电致化学发光适体传感器的近期进展作简要评述，包括适体概述以及几大类电化学适体传感器的构造、方法原理等内容。

适体；传感器；电致化学发光检测；识别分子

0 引言

电致化学发光（ECL），也称之为电化学发光，是将化学发光技术和电化学技术结合起来构建的一种分析方法。通过电化学的方法在电极表面生产了一些特殊的物质，这些物质之间或与其他组分之间通过电子传递形成激发态，当激发态物质回到稳定的基态时，伴随着产生化学发光[1-2]。在某种程度上讲，电致化学发光类似于光激发，比如荧光，但又具有荧光不具备的优点，不需要光源，可以避免光散射和杂质的发光干扰。电致化学发光技术是电化学与化学发光的结合，其既集成了发光与电化学分析技术的优点，又结合二者产生了新的优势[3]，具有灵敏度高，操作简便，易于控制，重现性和选择性好等优点[4-5]。

适体是从核酸文库中筛选出来的与配体具有高效和专一结合的DNA或RNA片段[6-7]。这些寡核苷酸片段通常是一段长度为25~80个碱基的单链寡核苷酸，不同的适体其可以与蛋白质、有机物、小分子、金属离子、多肽等各种配体具有特异性结合能力[8-10]。近几年来，以适体作为识别元件构建的电致化学发光适体传感器受到广大研究者的关注[11-12]。筛选出来的不同的核酸适体对某种多肽、蛋白、金属或者有机物具有高特异性和高亲和性的结合特性。将适体作为电致化学发光传感器的分子识别元件，与其它分子识别元件相比具有以下的优点[13-14]：(1)与目标物结合具有高的特异性和亲和性。适体只能识别与其互补的分子结构，从而避免非特异性结合；(2)体外筛选，具有可修饰性：适体的筛选过程不依

赖于动物或细胞培养，是通过SELEX技术进行体外筛选产生的，具有简单、快速和低成本的优势，此外，适体作为一段核苷酸片段，在不影响其生物活性的情况下方便对其两端进行修饰，如巯基、生物素、氨基等基团，也可修饰一些电活性物质、光活性物质或酶等，修饰后的适体更利于目标物的检测；(3)靶分子范围广：适体不仅可以作用于蛋白质与核酸，还适用于酶、细胞粘附分子、病毒颗粒、生长因子、抗体、病原菌等生物大分子，也可以用来检测小分子目标物如金属离子、有机染料、氨基酸、药物、抗生素、核苷酸、生物辅因子等；(4)稳定性好，可反复变性、复性，利于长期保存：抗体的蛋白质本质决定了它容易变性，保存时间短，而核酸适体冻成干粉后可以在室温下保存数年。与抗体相比，适体具有更好的稳定性和选择性。

该文主要介绍电致化学发光适体传感器，根据不同电致化学发光适体传感器的构造、工作原理等内容进行全面的评述。

1 根据电致化学发光适体传感器的构建原理分类

图1 单链核酸构建的电致化学发光适体传感器原理示意图[15]Fig.1 Schematic diagram of the principle for a single-strand based electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2008 Elesive

按照电致化学发光适体传感器的构建原理，将其分为三类：以单链核酸适体构建的电致化学发光适体传感器、以适体及其互补链共同构建的电致化学发光适体传感器、以两条单链核酸适体构建的夹心型电致化学发光适体传感器。

1.1 以单链核酸适体构建的电致化学发光适体传感器

单链核酸适体构建的电致化学发光适体传感器是将单链的核酸适体固载到电极表面，目标物与核酸适体直接结合，通过检测目标物与核酸适体结合前后电极表面的电致化学发光信号的变化来直接对目标物进行检测。Chen等[15]报道了一种利用标记有[Ru(bpy)3]2+的环糊精主客体识别作用结合适体构建的电致化学发光适体传感器用于检测三磷酸腺苷的方法，如图1所示，用电聚合的方法先将邻氨基苯甲酸聚合在玻碳电极表面，然后用N-羟基琥珀酰亚胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙烯碳二亚胺-盐酸盐作为交联剂将5端带–NH的适体连在电极上，通过主客体识别作用可以将标记了[Ru(bpy)3]2+的环糊精修饰在电极上，得到了很强的电致化学发光信号。当有三磷酸腺苷存在时，由于适体的特异性识别作用，会优先和目标物结合，从而减少了标记了[Ru(bpy)3]2+环糊精的量，得到了较低的信号。

结合前后电致化学发光信号的减小值就可以完成对目标分析物三磷酸腺苷的定量检测。这类传感器的优点是构建过程简单，便于实时监测。

1.2 以适体及其互补链共同构建的电致化学发光适体传感器

适体及其互补链共同构建的电致化学发光适体传感器是将标记有发光试剂或者猝灭剂探针的适体及其互补链形成的双链结构固载到电极表面，此时获得一个确定的电致化学发光信号，当适体与目标物结合后，双链中的适体或其互补链部分或完全脱离电极表面，从而引起原有的电致化学发光信号的改变，通过检测电极表面电致化学发光信号的变化值来实现对目标物的检测。

Zhang等[16]首先将发光物质联吡啶钌修饰在纳米金上，将复合物修饰到金电极表面，通过Au-S键将捕获探针修饰在电极表面，当15-碱基对的凝血酶适体和标记有二茂铁的DNA短链存在时，在电极表面3条DNA链可以形成一个“Y”结构的DNA杂交链，由于二茂铁对钌的发光有猝灭作用，得到一个低的电化学信号。当目标物凝血酶存在时，其与适体特异性结合，破坏了“Y”结构的DNA杂交链，使得标记了二茂铁的短链从电极表面脱离，使电致化学发光信号增加，根据电致化学发光信号的变化值就可以完成对目标物凝血酶的定量检测(图2)。

图2 适体及其互补链构建的电致化学发光适体传感器原理示意图[16]Fig.2 Schematic diagram of the principle for a double-strand based electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2011 Elesive

1.3 夹心型电致化学发光适体传感器

两条单链核酸适体构建的电致化学发光适体传感器是基于固载适体—目标检测物—标记适体的“三明治”模型构建的，主要适用于表面至少具有两个适体结合位点的目标物的检测。首先将其中一条适体作为捕获探针固定到电极表面，当其与目标分析物结合后，再将另一条标记有发光物质、纳米粒子、猝灭剂或共反应试剂等的检测适体与电极表面的目标检测物进行结合，形成捕获适体-目标检测物-标记适体的夹心结构。通过标记适体所引起的电致化学发光信号的改变来实现对目标分析物的检测。Hong等[17]用丙烯酸、Ru(bpy)3Cl26H2O和聚乙烯亚胺聚合反应得到一种聚合物作为电极的基底，得到一个强的电致化学发光信号，然后滴加纳米金作为适体1的捕获探针，与目标分析物凝血酶发生特异性识别后，再与hemin/TBA 2/Au@CeO2适体2结合形成夹心结构。由于hemin和CeO2对Ru的发光具有猝灭作用，其修饰量随着凝血酶浓度的增加而增加，从而致使传感器的电致化学发光强度随之降低，从而实现对凝血酶浓度的检测(图3)。这类传感器检测灵敏度较高，具有很强的抗干扰能力。

2 根据传感器构建过程中适体是否被标记进行分类

在传感器的构建过程中，根据传感器的构建需求对适体是否需要标记活性物质有不同的要求，从而将电致化学发光适体传感器分为免标记型和标记型两类：

图3 夹心型电致化学发光适体传感器的原理示意图[17]Fig.3 Schematic diagram of the principle for a double-strand based electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2008 ACS

2.1 免标记型电致化学发光适体传感器

免标记型电致化学发光适体传感器不需要对适体进行标记，可以直接根据适体与目标检测物结合前后所引起的电致化学发光信号的改变来进行检测。对于免标记的传感器来说，根据发光试剂的存在形式又有两种分类：一种是通过静电吸附作用将发光试剂直接吸附在适体链上；一种是将发光试剂直接修饰在电极表面。

将发光试剂通过静电吸附直接修饰到核苷酸链上。Li等[18]将巯基端的凝血酶适体链固定到金电极表面，通过静电吸附作用与发光试剂[Ru(bpy)3]2+作用，将发光试剂修饰到凝血酶适体上，获得一个可检测的电致化学发光信号，当目标分析物凝血酶存在时，与凝血酶结合后，目标物与适体结合脱离电极表面，使得电极表面[Ru(bpy)3]2+的量减少，发光信号减小，通过电化学信号的减少值就可以对凝血酶定量检测 (图4)。Jin等[19]基于树枝状滚环扩增反应构建了一个凝血酶适体传感器。该传感器先用一个单链DNA固载到金电极上，然后杂交凝血酶适体，使适体也固定在电极表面，当凝血酶存在时，适体-凝血酶结合脱离电极表面。此时，在大肠杆菌DNA的作用下，电极表面裸露的单链DNA与挂锁探针杂交环化。随后，挂锁探针担任树枝状滚环扩增反应的引发模板，和大量的双链DNA在电极表面杂交成树枝状。Ru(phen)32+(作为电致化学发光信号探针)嵌入双链DNA(dsDNA)的凹槽中，以产生电致化学发光信号，实现了对目标物的检测。

图4 发光试剂吸附在适体链上的免标记型电致化学发光适体传感器的原理示意图[18]Fig.4 Schematic diagram of the principle for a label-free electrochemiluminescence aptasensor with luminescent substance adsorption on aptamer.Copyright 2011 Elesive

将发光试剂直接修饰在电极表面。Dang等[20]通过将发光试剂[Ru(bpy)3]2+掺杂在壳聚糖和二氧化硅复合纳米材料中，然后用修饰了Nafion的玻碳电极吸附含有发光试剂的复合纳米材料，再

将富含G-结构的DNA适体链修饰在电极表面，这时电极可以显示比较高的发光信号。当检测物K+存在时，适体与目标物形成G-四分体结构，从而得到了低的发光信号(图5)。这类发光试剂直接修饰在电极表面的电致化学发光适体传感器具有无需标记、稳定性好、操作简单、成本低且不损伤适体的活性等优点，但是检测的灵敏度相对比较低。

图5 发光试剂修饰在电极表面的免标记型电致化学发光适体传感器的原理示意图[20]Fig.5 Schematic diagram of the principle for a label-free electrochemiluminescence aptasensor with[Ru(bpy)3]2+modified on the electrode surface.Copyright 2014 ACS

2.2 标记型电化学适体传感器

标记型电化学适体传感器通常是用共价键将发光试剂(如钌配合物、鲁米诺)、纳米粒子(如量子点、纳米金、纳米铂等)、共反应试剂、发光试剂猝灭剂等与适体标记起来[21-22]，然后根据被标记的适体与目标分析物特异性结合前后所产生的电致化学发光信号的改变来实现对目标物浓度的定量检测。这类方法受到广大的关注。标记方法可以直接在筛选适体时标记，也可以用各种纳米材料做媒介将适体与其他物质标记在一起。Gan等[23]将Ru-Pt复合纳米材料修饰在电极基底，然后将一段共反应试剂4-(二甲基氨基)丁酸标记的适体修饰到金电极表面，在没有目标物茶树碱分子存在时，共反应试剂4-(二甲基氨基)丁酸的存在可以增强钌的发光，从而得到强的电致化学发光信号，当凝血酶与其适体特异性结合后，共反应试剂4-(二甲基氨基)丁酸标记的适体脱离电极，从而减低了发光信号(图6)。

3 根据适体与目标分析物结合前后信号的变化分类

电致化学发光适体传感器按照适体与目标分析物特异性识别前后电致化学发光信号的改变可以分为信号衰减 (signal-off)型和信号增强(signal-on)型两类：

3.1 Signal-off型电致化学发光适体传感器

Signal-off型电致化学发光适体传感器是以目标分析物与适体结合后所导致的传感器电致化学发光信号的衰减程度作为定量分析的信号。Yu等[24]通过DNA互补方法用凝血酶适体的互补链将适体固定于电极表面，再与凝血酶结合，没有结合的凝血酶适体与N-(氨基乙基)-N-(乙基异鲁米诺)可以产生一个电致化学发光信号，并且这个信号随着凝血酶量的增加而递减。Liu等[25]利用多巴胺黑色素纳米球作为信号放大标签，作为发光试剂[Ru(bpy)3]2+的载体，将其修饰在电极上制备了一种signal-off型电致化学发光适体传感器，首先将纳米复合物通过自组装修饰到玻碳电极表面，然后吸附一层纳米金在电极上，利用Au-S键将凝血酶适体修饰到电极上，当目标物与对应的适体特异性结合后，由于目标蛋白对于电子传递的阻碍作用，使得发光响应信号减小(图7)。从而成功制得了signal-off型电化学适体传感器。这类电致化学发光适体传感器是根据适体与目标分析物结合后导致发光信号降低来完成对目标分析物的定量检测。该方法本身有

一定的局限性，由于信号是降低的，所以需要有较大的背景信号，容易受其他干扰物质的影响产生的“假信号”与目标物所产生的信号不容易区别，从而限制了传感器的灵敏度。

图6 标记型电致化学发光适体传感器的原理示意图[23]Fig.6 Schematic diagram of the principle for the coreactant-labeled electrochemiluminescence aptasensor. Copyright 2012 Elesive

图7 信号衰减型电致化学发光适体传感器的原理示意图[25]Fig.7 Schematic diagram of the principle for the signal-off electrochemiluminescence aptasensor.Copyright 2014 Elesive

3.2 Signal-on型电致化学发光适体传感器

Signal-on型电致化学发光适体传感器是以目标分析物与适体结合后所导致的电致化学发光信号的增强程度作为定量分析的依据。该方法克服了signal-off型电致化学发光适体传感器的背景信号高、假信号等缺点，能够准确、快速的实现目标物分析，提高检测对象的灵敏度。Su等[26]将金合石墨烯复合物固定到玻碳电极表面，然后将刀豆A修饰到电极表面用来捕获MCF-7癌细胞，MUCI适体标记在有碳量子点的多空硅纳米球上，当MUCI适体与MCF-7癌细胞作用后，将发光试剂碳量子点固载在电极表面，MCF-7癌细

胞的浓度的越大，结合到电极表面的碳量子点标记的MUCI适体越多，电致化学发光信号增强，从而成功构建了一种signal-on型电致化学发光适体传感器(图8)。

图8 信号增强型电致化学发光适体传感器的原理示意图[26]Fig.8 Schematic diagram of the principle for the signal-on electrochemiluminescence aptasensor.Copyright 2014 Elesive

4 展望

近年来，电致化学发光适体传感器的研究得到了飞速的发展，在电致化学发光适体传感器的设计、分析特性如灵敏度、线性范围和稳定性的改善，以及应用范围等研究方面取得了显著的进展。目前，电致化学发光适体传感器的研究仍然是一个十分活跃的研究领域。寻找新的目标物适体、设计新颖的传感器模式以及进一步提高电致化学发光适体传感器的灵敏度和稳定性，尤其是在临床医学诊断和药物筛选上的实际应用等方面的研究更是目前电致化学发光适体传感器发展的方向。

[1]Richter M M.Electrochemiluminescence(ECL)[J]. Chem.Rev.,2004.104:3003-3036.

[2]Hu L Z,Xu G B.Applications and trends in electrochemiluminescence[J].Chem.Soc.Rev.,2010,39:3275-3304.

[3]王晓英.基于电致化学发光技术的纳米生物传感器的设计与研究[D].上海:华东师范大学,2008.1-2.

[4]Zhu X,Zhang Y S,Yang W Q.Highly sensitive electrochemiluminescent biosensor for adenosine based on structure-switching of aptamer[J].Anal.Chim.Acta, 2011,684:121-125.

[5]Zu Y B,Ding Z.Impedance feedback control for scanning electrochemical microscopy[J].Anal.Chem.,2001,73: 2153-2156.

[6]Ellington A D,Szostak J W.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature,1990, 346(6287):818-822.

[7]Tuerk,C,Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Science,1990,249 (4968):505-510.

[8]Jian Y,Gao Z,Sun J,et al.RNA aptamers interfering with nucleophosmin oligomerization induce apoptosis of cancer cells[J].Oncogene,2009,28(47):4201-4211.

[9]Hamula C L,Guthrie J W,Zhang H,et al.Selection and analytical applications of aptamers[J].TrAC Trend Anal. Chem.,2006,25(7):681-691.

[10]Tombelli S,Minunni M,Mascini M.Analytical applications of aptamers[J].Biosens.Bioelectron.,2005,20 (12):2424-2434.

[11]Zhang M H,Yuan R,Chai Y Q,et al.A biosensor for cholesterol based on gold nanoparticles-catalyzed luminol electrogenerated chemiluminescence[J].Biosens. Bioelectron.,2012,32:288-292.

[12]Wang H J,Bai L J,Chai Y Q,et al.Synthesis of multifullerenes encapsulated palladium nanocage,and its application in electrochemiluminescence immunosensors for the detection of streptococcus suis serotype 2[J].

Small,2014,10:1857-1865.

[13]Kandimalla V B,Ju H.New horizons with a multi dimensional tool for applications in analytical chemistry-aptamer[J].Anal.lett.,2004,37:2215-2233.

[14]Patel D J,Suri A K.Structure,recognition and discrimination in RNA aptamer complexes with cofactors,amino acids,drugs and aminoglycoside antibiotics Reviews[J]. Mol.Biotechnol.,2000,74:39-60.

[15]Chen H,Chen Q,Zhao Y,et al.Electrochemiluminescence aptasensor for adenosine triphosphate detection using host–guest recognition between metallocyclodextrin complex and aptamer[J].Talanta,2014,121:229-233.

[16]Zhang J,Chen P,Wu X Y,et al.A signal-on electrochemiluminescence aptamer biosensor for the detection of ultratrace thrombin based on junction-probe[J]. Biosens.Bioelectron.,2011,26:2645-2650.

[17]Hong L-R,Chai Y-Q,Zhao M,et al.Highly effcient electrogenerated chemiluminescence quenching of PEI enhanced Ru(bpy)32+nanocomposite by hemin and Au@CeO2Nanoparticles[J].Biosens.Bioelectron.,2015, 63:392-398.

[18]Li Y,Qi H,Gao Q,et al.Label-free and sensitive electrogenerated chemiluminescence aptasensor for the determination of lysozyme[J].Biosens.Bioelectron.,2011, 26:2733-2736.

[19]Jin G X,Wang C M,Yang L L,et al.Hyperbranched rolling circle amplification based electrochemiluminescence aptasensor for ultrasensitive detection of thrombin [J].Biosens.Bioelectron.,2015,63:166-171.

[20]Dang J,Guo Z,Zheng X.Label-Free sensitive electrogenerated chemiluminescence aptasensing based on chitosan/Ru(bpy)32+/silica nanoparticles modifed electrode [J].Anal Chem.,2014,86:8943-8950.

[21]Shi H W,Wu M S,Du Y,et al.Electrochemiluminescence aptasensor based on bipolar electrode for detection of adenosine in cancer cells[J].Biosens.Bioelectron., 2014,55:459-463.

[22]Zhuo B R,Li Y Q,Huang X,et al.An electrochemiluminescence aptasensing platform based on ferrocenegraphene nanosheets for simple and rapid detection of thrombin[J].Sens.Actuators,B-Chem.,2015,208: 518-524.

[23]Gan X,Yuan R,Chai Y,et al.4-(Dimethylamino)butyric acid@PtNPs as enhancer for solid-state electrochemiluminescence aptasensor based on target-induced strand displacement[J].Biosens.Bioelectron.,2012,34:25-29.

[24]Yu X,Cui H.Electrochemiluminescence bioassay for thrombin based on dynamic assembly of aptamer,thrombin and N-(aminobutyl)-N-(ethylisoluminol)functionalized gold Nanoparticles[J].Electrochim.Acta,2014, 125:156-162.

[25]Liu Y M,Zhang J J,Shi G F,et al.Label-free electrochemiluminescence aptasensor using Ru(bpy)32+functionalized dopamine-melanin colloidal nanospheres and gold nanoparticles as signal-amplifying tags[J].Electrochim.Acta,2014,129:222-228.

[26]Su M,Liu H,Ge L,et al.Aptamer-Based electrochemiluminescent detection of MCF-7 cancer cells based on carbon quantum dots coated mesoporous silica nanoparticles[J].Electrochimica Acta,2014,146:262-269.

Electrochemiluminescence aptasensors-recent achievements

Gui Guo-feng*,Song Peng
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University of Engineering Science,Bijie 551700,China)

Aptamers are DNA or RNA oligonucleotides selected in vitro that can bind their target with high affinity and high specificity.Their specificity is comparable and in certain case even higher than those of antibodies. Aptamers can selectively bind to low-molecular-weight organic or inorganic substrates or to macromolecules such as proteins.In this view,we briefly summarize the recent progress of electrochemiluminescence aptasensors,involving introduction of aptamer and the main aptasensors about their configuration and some detection technologies.

aptamers;sensors;electrochemiluminescence;recognition molecules

贵州省教育厅自然科学重点项目（黔教合KY字[2015]388）；中央高校基本科研业务费（XDJK2014C001）；贵州省教育厅自然科学青年项目（黔教合KY字[2015]450）；贵州省煤基新材料工程中心（黔教合KY字[2012]026号）

*通信联系人，E-mail：ggfok@21cn.com