张丽君

二恶英对内膜组织中细胞色素芳香化酶P450表达的影响

张丽君

目的 建立小鼠模型并探讨二恶英对小鼠内膜组织中细胞色素芳香化酶P450表达的影响。方法 建立小鼠模型, 采用二恶英0、3、10 μg/kg对小鼠进行宫内、外暴露或宫内宫外联合暴露,从而将小鼠模型分为五组：0-0组、3-0组、0-3组、3-3组和3-10组, 各有24只小鼠。采用免疫组织化学法检测小鼠模型中子宫内膜组织中细胞色素芳香化酶P450的表达水平。结果 细胞色素芳香化酶P450在小鼠暴露组的表达高于对照组(P＜0.05), 并随二恶英暴露剂量的增加而升高(P＜0.05)。结论 二恶英可以促进子宫内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达。

二恶英；小鼠模型；细胞色素芳香化酶P450

二恶英是一种常见的环境污染物, 广泛存在于人类生存环境中, 严重威胁人的身体健康。证据表明二恶英与妇科雌激素依赖性疾病的发病关系密切［1］, 细胞色素芳香化酶P450是合成雌激素的限速酶, 主要以合成雌激素而发挥作用。本研究建立小鼠模型, 使用不同剂量二恶英对其进行宫内、外暴露或联合暴露, 检测子宫内膜组织中细胞色素芳香化酶P450表达程度, 以探讨二恶英对其表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物建模 参考Audrey M.Cummings1999年锯齿类动物实验模式建模。将60只SPF级C57BL/6雌鼠和30只SPF级C3H雄鼠在成熟期以2：1合笼, 将怀孕后的雌鼠随机分为二恶英组40只和对照组20只。在妊娠的第8天通过给予暴露组口服二恶英类化合物TCDD 3 μg/kg, 母鼠产后共选择雌性子鼠120只：在原对照组中选择48只, 分为0 μg/kg和3 μg/kg组。在原暴露组中选择72只, 分为0 μg/kg、3 μg/kg和10 ug/kg组。根据小鼠二恶英暴露时间及暴露剂量的不同将其分为五组, 0-0组, 3-0组, 0-3组, 3-3组, 3-10组, 每组含24只子鼠。在子鼠出生后第21天和49天给予0-3组、3-3组、3-10组二恶英类化合物各3 μg/kg, 3 μg/kg, 10 μg/kg,出生后第70天将全部小鼠处死, 取其子宫内膜固定备用。

1.2 方法 使用免疫组织化学方法进行连续切片, 常规脱蜡、水化、抗原修复；封闭非特异性抗原30 min, 滴加鼠抗人P450单克隆抗体, 室温孵育2.5 h, 用PBS冲洗3次, 二抗于室温下孵育50 min, 后DAB显色5 min, 清水冲洗终止反应, HE染色, 中性树胶封片。这种抗体在腺上皮及间质细胞浆中表达, 胞浆内有棕黄色颗粒沉着者即为阳性表达。

1.3 P450表达 免疫组化结果判断细胞色素芳香化酶P450的表达是腺上皮细胞胞浆内出现有棕黄色的颗粒, 染色结果通过在光镜下定位, 摄像系统摄取细胞图像, 之后输入医学图像分析系统进行处理, 以平均光密度计算细胞色素芳香化酶P450的表达情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

细胞色素芳香化酶P450蛋白位于暴露组小鼠子宫内膜腺上皮细胞的胞浆内。0-0组小鼠子宫内膜中没有细胞色素芳香化酶P450表达, 其余各组均有表达, 3-0组(0.1453±0.0372), 0-3组(0.1729±0.0435), 3-3组(0.2349± 0.0593), 3-10组为(0.2756±0.0322), 其表达量按照0-0组、3-0组、0-3组、3-3组、3-10组的顺序依次增加, 任意两组之间的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

二恶英主要产生于化工生产、汽车尾气及城市废弃物中, 可通过多种途径进入人体危害人的健康, 其主要方式是通过服用被二恶英污染的水、食物以及吸入含有二恶英类化合物的汽车尾气。二恶英属于剧毒化合物, 不能在人体中进行对照研究。因此为了对其进行研究分析, 需要建立动物模型。小鼠具有体型小、生长周期短、成熟早、饲养方便、繁殖力强等特点, 使用小鼠建立动物模型具有相对的优越性。研究表明二恶英对哺乳类动物的生殖系统产生危害［2］, 另有研究表明子宫内膜不仅受到血液循环中雌激素的作用, 还能够通过自分泌或者旁分泌的方式产生雌激素, 使局部雌激素分泌过多, 为雌激素依赖性疾病的发生创造了条件。细胞色素芳香化酶P450是合成雌激素的限速酶, 通过分泌雌激素对周围组织产生作用, 本研究通过对小鼠子宫内膜的检测发现, 细胞色素芳香化酶P450的表达量按0-0组, 3-0组, 0-3组, 3-3组和3-10组的顺序依次增加。0-0组没有细胞色素芳香化酶P450蛋白表达, 3-0组小鼠即母体妊娠期暴露在二恶英中, 其子代小鼠内膜中开始出现细胞色素芳香化酶P450表达, 说明妊娠期暴露促进子代内膜中雌激素的分泌, 导致子代患雌激素依赖性疾病的风险增加。3-3组小鼠和3-0组相比, 子代二恶英暴露增加, 细胞色素芳香化酶P450表达量也增加。说明细胞色素芳香化酶P450的表达随着二恶英暴露时间的延长而增加, 同时也说明了宫内宫外联合暴露比单一宫内暴露更能促进细胞色素芳香化酶P450的表达。同样, 3-3组小鼠和0-3组相比多了一次宫内暴露, 内膜中细胞色素芳香化酶P450表达量也同时增多, 说明二恶英宫内宫外联合暴露比单一宫外暴露更能促进细胞色素芳香化酶P450的表达, 从而使子宫内膜局部雌激素合成增加, 患雌激素依赖性疾病的风险也更大。在3-10组中, 二恶英暴露次数和3-3组相同, 但剂量加大, 使子宫内膜中细胞色素芳香化酶P450表达量也更大, 说明细胞色素芳香化酶P450表达量随二恶英剂量增加而增加, 使雌激素分泌进一步增加, 患病风险也更大。Boverhof等的研究也表明二恶英可产生一种类似雌激素的作用。

二恶英是目前国际上公认的最严重的生殖危险环境污染物之一, 流行病学调查显示, 长时间暴露在二恶英中不仅患生殖系统疾病的风险增加, 还能够增加人体其他疾病的患病率, 如恶性肿瘤等。医务人员应积极采取相应措施来防范其对人体的危害, 如提倡垃圾及时分类处理, 控制焚烧, 从而降低二恶英类化合物的排放量, 减少二恶英所引起的相关疾病的发生［2］。

［1］ 张丽君, 黄向华.四氯二苯并二恶英与妇科疾病.国际生殖健康/计划生育杂志, 2011, 30(2):134-137.

［2］ 郭玉梅,王沭沂,王心如.二恶英对猕猴妊娠期及其妊娠结局的毒性影响.中国公共卫生, 2000, 16(11):1001-1002.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.02.183

2014-09-04］

473000 南阳医专一附院妇科