翟玉荣 刘 波(遵义医学院珠海校区药理教研室，广东 珠海 5904)

苦瓜提取物对糖尿病大鼠早期肾损伤的保护作用

翟玉荣 刘 波1(遵义医学院珠海校区药理教研室，广东 珠海 519041)

目的 探讨苦瓜提取物(MCE)对糖尿病(DM)大鼠早期肾损伤的保护作用及其作用机制。方法 链脲佐菌素(STZ)诱导产生大鼠DM模型，随机将大鼠分为正常组(NC)、模型组(DN)、MCE预防给药低、高剂量组(A、B组)、MCE治疗给药低、高剂量组(C、D组)。检测各组大鼠肾脏肥大指数、血糖、测定24 h尿蛋白量、24 h尿微量白蛋白排泄量(UAE)量及尿中β2-球蛋白(β2-MG)浓度及肾皮质丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化，苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏病理学变化。结果 A、B、C、D各组均能明显降低DN组大鼠的血糖、肾指数及24 h尿蛋白量、24 h UAE量、尿β2-MG浓度，并显著降低肾皮质MDA含量和明显升高SOD活性(P＜0.05或P＜0.01)，且MCE各给药组均在不同程度上减轻了DN组大鼠的肾小球结构模糊、细胞数增多等病理变化;同剂量下，A组较C组，B组较D组效应更显著(P＜0.05或P＜0.01)。结论 苦瓜提取物对DM的早期肾损伤有一定保护作用，其作用机制可能与其抗氧化应激作用有关。

苦瓜提取物;糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是2型糖尿病(DM)最常见和最严重的并发症之一〔1〕，目前尚无特效药物治疗。具有辅助降血糖、降血脂、抗氧化、增强免疫力及预防肥胖等保健功能〔2〕。有文献〔3〕表明苦瓜皂苷对 DN有一定保护作用，但苦瓜提取物(MCE)对DN早期肾损伤的保护作用还未见报道。本实验以链脲佐菌(STZ)诱导2型DM大鼠肾损伤模型，重点观察苦瓜提取物不同给药方案疗效有何差异，并观察其对肾皮质中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，初步探讨苦瓜提取物对DN的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 选用健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重200～250 g(广东省医学实验动物中心提供)，合格证号scxk(粤)2011-0002。

1.2 药品与试剂 MCE(购于福州日冕科技开发有限公司，产品标准号:Q/RM0513-KG-2011，甙与苦瓜苷1%)。STZ(美国Sigma公司生产)。考马斯亮蓝蛋白、尿蛋白、微量白蛋白(UAE)、β2微球蛋白(β2-MG)的测试盒均购于南京建成生物公司;One Touch自动血糖分析仪及配套试纸(美国强生公司)，SN-6930A型液闪仪与sN-6100型γ计数器(上海核所日环光电公司)。

1.3 DM模型制备与分组 60只大鼠按体重随机分为正常组(NC)、模型组(DN)、MCE预防给药低、高剂量组(A组、B组)、MCE治疗给药低、高剂量组(C组、D组)。每组10只。各组大鼠自由进食、饮水。大鼠适应性喂养1 w后，禁食12 h，除正常组外，其余各组大鼠用 0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH4.2，4℃)临用前配成1%STZ溶液，按60 mg/kg给予腹腔注射，72 h后分别取上述各组大鼠尾尖血测血糖，1次/d，连续3 d，以空腹血糖≥16.7 mmol/L者，视为DM大鼠模型已制成。NC组给予同等容量的枸橼酸溶液腹腔注射。各组均给予普通饲料，自由饮水。

1.4 给药方法 A组、B组于造模前2 w开始给药，分别按100 mg/kg及300 mg/kg剂量每日灌服苦瓜提取物，1次/d;C组、D组于成模后第3天开始给药，给药剂量及方法同治疗组;NC和DN组造模后第3天，每日灌服与给药组相同体积的蒸馏水，各组均连续给药至成模后4 w末。

1.5 一般项目观察 包括大鼠的精神状态、毛色、饮食量、尿量、体重等。实验结束后处死动物后，称量左侧肾重，计算肾脏肥大指数。肾肥大指数 =(左肾重/体重)×100%。

1.6 尿、血生化指标测定 实验结束前收集24 h尿液，以放射免疫法测定24 h尿蛋白量、24 h UAE及β2-MG浓度，具体步骤按照试剂盒说明书进行。腹主动脉取血，采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。

1.7 肾皮质MDA含量、SOD活性测定 取0.3 g肾皮质置于玻璃皿中，加入9倍体积的冷生理盐水，在冰浴条件下剪碎并制成匀浆，取浓度为100 g/L的组织匀浆以4 000 r/min离心15 min，留上清液待测。采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量(nmol/mgprot)、黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性(U/mgprot)，测定具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.8 肾脏病理变化观察 取左肾“去包膜”置于40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm切片行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察病理变化。

1.9 统计学分析 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 NC组大鼠活跃，毛色光滑，精神状况良好，反应灵敏，体重增长较快;DN组大鼠出现多饮多食多尿，明显消瘦，精神萎靡，毛色晦暗，行动迟缓，体重减轻或增长缓慢;A组和B组精神状况良好，体重减轻，反应灵敏度较正常组稍差;C组和D组精神状况，体重变化及反应灵敏度与A、B组情况相近，但较NC组稍差。

2.2 MCE对DM大鼠血糖、肾指数及尿中蛋白的影响 DN组与NC组相比，空腹血糖、肾指数及24 h尿蛋白、U-MA量及尿β2-MG 浓度均明显升高(P＜0.01);与 DN 组相比，A、B、C、D 各组空腹血糖、肾指数及24 h尿蛋白、UAE量及尿β2-MG浓度均显著下降(P＜0.05或P＜0.01);同剂量下组间比较，A组与C组、B组与D组之间比较血糖下降均无明显差异(P＞0.05)，B组较D组肾指数减小更为明显，差异显著(P＜0.05)，A组较C组肾指数下降稍明显，但差异不显著(P＞0.05)，24 h尿蛋白、UAE量及尿β2-MG浓度，A组较C组、B组较D组下降更为明显(P＜0.05或 P＜0.01)，见表 1。

2.3 MCE对肾组织病理形态改变的影响 NC组大鼠肾小球结构清楚，大小较一致，肾小球血管袢薄而清晰，无系膜增生，肾小球内细胞数没有明显增加，其周肾小管基本正常;DN组大鼠肾小球结构模糊，呈分叶状，系膜细胞增生，肾小球内细胞数明显增加。MCE各给药组较DN组相比，上述改变有所减轻，周围肾小管结构相对正常，且A组比C组，B组比D组病理变化减轻较为显著，见图1。

2.4 MCE对DM大鼠肾皮质MDA、SOD的影响 与NC组相比，DN组肾皮质MDA含量明显升高、SOD活性明显下降(P＜0.01);与模型组相比，A、B、C、D各组MDA含量显著降低、SOD活性显著升高(P＜0.05或P＜0.01);同剂量下，A组较C组、B组较D组的SOD活性升高程度更为明显，两组间比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)，而MDA含量变化A组较C组、B组较D组两组间比较无显著差异(P＞0.05)，见表2。

表1 MCE对DM大鼠血糖、肾指数及尿中蛋白的影响(±s，n=10)

表1 MCE对DM大鼠血糖、肾指数及尿中蛋白的影响(±s，n=10)

与 NC 组比较:1)P＜0.01;与 DN 组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01;与 C 组比较:4)P＜0.05，5)P＜0.01;与 D 组比较:6)P＜0.05，7)P＜0.01;下表同

组别 剂量(mg/kg) 空腹血糖(mmol/L) 肾指数(mg/g) 尿蛋白(mg/24 h) UAE(mg/24 h) β2-MG(mg/L)2±0.03 DN 组 － 19.95±0.571) 4.85±0.591) 53.2±3.41) 4.25±0.311) 0.35±0.051)A 组 100 17.12±0.833) 3.89±0.683) 24.3±2.73)4) 1.73±0.463)5) 0.22±0.033)B 组 300 15.96±1.173) 3.58±0.483)4) 20.1±1.33)6) 1.15±0.233)7) 0.16±0.033)6)C 组 100 17.58±1.652) 4.13±0.323) 29.8±2.63) 3.62±0.682) 0.21±0.033)D 组 300 16.20±1.083) 4.08±0.792) 27.2±1.83) 2.42±0.343) 0.20±0.023)NC 组 － 5.65±0.41 3.13±0.62 14.6±1.2 0.91±0.36 0.2

图1 各组大鼠DM早期肾脏病理形态学变化(HE，×400)

表2MCE对糖尿病大鼠肾皮质MDA、SOD的影响(±s，n=10)

表2MCE对糖尿病大鼠肾皮质MDA、SOD的影响(±s，n=10)

组别 剂量(mg/kg)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)NC组-2.65±0.41 320.44±40.60 DN 组 - 7.16±0.571) 187.06±27.721)A 组 100 5.62±0.833) 235.63±42.492)4)B 组 300 5.01±1.173) 241.08±61.893)6)C 组 100 5.76±1.653) 219.94±32.402)D 组 300 5.56±1.083) 226.06±35.822)

3 讨论DN

病变主要累及肾小球，亦可累及肾小管，而蛋白尿是DN最重要的临床特征，与DN的严重程度及病情进展密切相关。肾小球病变时尿蛋白主要以中高分子质量蛋白为主，肾小管病变时尿蛋白主要以微量白蛋白、β2-MG等小分子质量蛋白为主〔4〕，因此，检测尿中不同分子质量的蛋白质成分及其水平变化可间接反映DN病人肾损伤的部位和程度，是肾早期损伤的敏感指标，也是治疗效果的直接判断指标。本实验结果提示，MCE对DN的早期肾损伤有一定的保护作用，疗效上，预防给药组要优于治疗给药组。

DN机制尚未完全阐明，氧化应激是其发生发展的共同机制〔5〕。DM时肾组织糖代谢紊乱，葡萄糖通过自身氧化、氧化磷酸化、非酶糖基化等途径产生过多活性氧，而肾组织抗氧化物质如SOD等显著减少，脂质过氧化产物MDA及其降解产物含量增高〔6〕。过量的活性氧对肾小球内皮、上皮及系膜细胞的直接损伤和趋化作用，吸引中性粒细胞及单核巨噬细胞在血管周围浸润，从而改变肾小球毛细血管和基底膜的通透性及血流动力学，造成大量持续性蛋白尿〔7〕。本实验结果提示MCE DN早期肾损伤的肾保护作用可能与其抗氧化应激作用有关。

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R285;R97

A

1005-9202(2015)09-2358-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.021

贵州省卫生厅科学技术基金项目(No.gzwk2009-1-067)

1 生理教研室

刘 波(1978-)，男，硕士，讲师，主要从事肾脏生理研究。

翟玉荣(1976-)，女，硕士，副教授，主要从事心血管药理及新药研发研究。

〔2014-12-20修回〕

(编辑 李相军/滕欣航)