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慢性阻塞性肺病大鼠血红素加氧酶-1表达及其临床意义

2015-01-31张一兵辽宁医学院附属第三医院辽宁锦州121000

中国老年学杂志 2015年9期
关键词:光镜血红素生理盐水

徐 冰 张一兵 (辽宁医学院附属第三医院,辽宁 锦州 121000)

慢性阻塞性肺病大鼠血红素加氧酶-1表达及其临床意义

徐 冰 张一兵 (辽宁医学院附属第三医院,辽宁 锦州 121000)

目的 探讨血红素加氧酶(HO)-1在慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠肺组织中的表达及其临床意义。方法 Wistar健康雄性大鼠60只随机分为模型组、药物干预组、生理盐水对照组各10只,分别给予烟熏配合脂多糖造模,烟熏配合脂多糖造模+大蒜素6.17 mg/kg灌胃,正常喂养等干预措施,5 w后进行肺功能测定,包括动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、氧合指数(PaO2/FiO2)。同时光镜下观察肺脏的形态,采用RT-PCR法检测各组HO-1 mRNA的表达。结果 与生理盐水对照组比较,模型组3 s用力呼气容积(FEV)3.0/用力肺活量(FVC)、呼气峰流速(PEF)、PaO2、PaO2/FiO2、HO-1 蛋白及基因表达下降显著(P<0.01),PaCO2升高显著(P<0.01)。与模型组比较,药物干预组 FEV3.0/FVC、PEF、PaO2、PaO2/FiO2、HO-1蛋白及基因表达升高显著(P<0.01),PaCO2下降显著(P<0.01)。各组光镜下肝脏显示:生理盐水对照组肺结构清晰,肺泡间毛细血管轻度扩张,部分支气管旁间质存在少许淋巴细胞浸润;模型组肺组织结构模糊,肺泡间毛细血管扩张明显并伴有出血,见大小不一凝固性肺坏死灶;药物干预组肺组织结构尚清,少量毛细血管扩张充血,肺泡腔内存在少许水肿液。结论 HO-1可能在COPD的发病过程中起保护作用,大蒜素改善COPD大鼠肺功能结构。

血红素加氧酶;慢性阻塞性肺病(COPD);大蒜素;mRNA表达

慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制的研究主要包括蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说、炎症学说、氧化抗氧化失衡学说,关于蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说和炎症学说已有较多研究。随着近期环境污染、雾霾及机体反应氧化物质的增多,氧化抗氧化失衡学说已受到重视。血红素加氧酶(HO)-1是一种最广泛存在的抗氧化防御酶,具有抗炎、抗氧化损伤、抗凋亡、抗增生的生理功能,可被多种刺激因素所诱导产生高水平的表达,如热休克、重金属、内毒素、血红素、细胞因子、紫外线等〔1,2〕。本研究通过动物实验从基因及蛋白两方面水平研究HO-1在COPD大鼠肺组织中的表达。

1 资料与方法

1.1 主要仪器 LEICA CM1850冰冻切片机(美国Beckman公司),光学显微镜(日本OLYMPUS公司),全自动生化分析仪(美国Beckman公司),XD711酶标仪(美国Beckman公司),小动物肺功能测定系统(美国Beckman公司),PHYⅢ型病理组织漂烘处理仪(冷泉港生物科技股份有限公司),电热自动恒温水温箱(上海医疗器械厂)等。

1.2 主要试剂 SP免疫组化试剂盒(PV-6001)购自北京中杉生物试剂公司;DAB增强性显色试剂盒(ZL19032)购自北京中杉生物试剂公司;HO-1酶联免疫试剂盒(hemin)和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司;大鼠HO-1 ELISA试剂盒和 HO-1 ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。

1.3 COPD动物模型制备 健康Wistar健康雄性大鼠60只(由辽宁医学院动物中心提供),SPF级别,体重(230±18)g。随机分为模型组20只,给予烟熏配合脂多糖(LPS,美国Sigma公司)处理〔3〕,第 1、15 天气管内滴入 LPS 200 μg,其余时间烟熏2次/d,每次60 min,共5 w;药物干预组20只,烟熏配合LPS造模后于第16天给予大蒜素,每天按体重6.17 mg/kg灌胃;生理盐水对照组20只,第1、15天气管内滴入无菌注射用水0.2 ml,其余时间正常条件下饲养。

1.4 肺功能测定 5 w后,测定3 s用力呼气容积占用力肺活量的比值(FEV3.0/FVC)和呼气峰流速(PEF)。末日熏吸香烟后用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,取仰卧位,测定动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、氧合指数(PaO2/FiO2)〔3〕。

1.5 光镜下观察肺脏的形态 组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固→SP免疫组化→光镜下观察肺脏的形态,采用大鼠HO-1试剂盒用ELISA方法检测HO-1的蛋白表达。

1.6 RT-PCR法检测HO-1 mRNA的表达 取对数生长期细胞,以5×104个/ml接种于6孔板。培养12 h后,每孔加入1 ml Trizol提取总RNA,测RNA浓度,反转录获得cDNA。定量PC R 程序:起始95℃解链 5 min,扩增程序为 95℃15 s,60℃15 s,72℃50 s,共40个循环。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因,所使用的引物见表1。

表1RT-PCR所用引物

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组动脉血气分析结果 与生理盐水对照组比较,模型组 FEV3.0/FVC、PEF、PaO2、PaO2/FiO2下降显著(P<0.01),PaCO2升高显著(P<0.01)。与模型组比较,药物干预组FEV3.0/FVC、PEF、PaO2,PaO2/FiO2升高显著 (P <0.01),PaCO2下降显著(P<0.01),见表2。

表2 各组动脉血气分析结果(±s,n=20)

表2 各组动脉血气分析结果(±s,n=20)

与生理盐水对照组比较:1)P<0.01;与模型组比较:2)P<0.01

组别 FEV3.0/FVC(%) PEF(ml/s) PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) PaO2/FiO2生理盐水对照组 75.6±12.0 42.8±7.6 90.2±12.0 38.6±8.2 432.1±20.3模型组 54.0±9.21) 24.6±4.41) 55.2±11.61) 61.4±5.51) 255.9±34.01)药物干预组 62.3±5.92) 29.5±8.22) 88.7±10.32) 40.0±6.72) 422.5±32.72)

2.2 肺组织光镜学检查 生理盐水对照组肺结构清晰,肺泡间毛细血管轻度扩张,部分支气管旁间质存在少许淋巴细胞浸润。模型组肺组织结构模糊,肺泡间毛细血管扩张明显并伴有出血,同时可见大小不一凝固性肺坏死灶的存在。药物干预组肺组织结构尚清,肺泡间隔内少量毛细血管扩张充血,肺泡腔内存在少许水肿液。见图1。

图1 各组肺组织光镜学检查(HE染色,×40)

2.3 各组肺组织HO-1蛋白和mRNA表达 与生理盐水对照组(5.06±0.05)比较,模型组 HO-1 蛋白表达(3.31±0.03)下降显著(P<0.01)。与模型组比较,药物干预组HO-1蛋白表达(5.01±0.01)升高显著(P<0.01)。各组 HO-1 mRNA 表达亦然,见图2。

图2 各组肺组织HO-1 mRNA表达

3 讨论

HO-1是一种存在于微粒体中氧化还原酶,是一种催化血红素降解为一氧化碳、铁和胆红素的起始酶及限速酶,生物学功能较为明显〔4〕,属于抗氧化防御酶,被认为是细胞应激的主要敏感指标之〔2,3〕。血红素降解过程是一系列自身催化的氧化反应过程。该过程需要NADPH-细胞色素P-450还原酶和分子氧的参与。它作用于血红素的α-亚甲基桥,在许多生理和病理过程中起到重要调节作用。

氧化/抗氧化失衡是COPD的主要发病机制之一〔5〕。近期报道显示,诱导HO-1的产生是机体氧化应激的标识,通过HO-1作用产生的胆色素比维生素E的抗氧化作用更强,因此推测HO-1所催化的反应是机体对氧化应激的一种反应,以此来达到对细胞的保护。吸烟者HO-1的诱导表达不足可能会增加患COPD的风险。Shinohara等〔6〕证实通过腺病毒基因转染的大鼠使HO-1表达增加,能够改善胰弹性蛋白酶导致的炎症反应、促炎症因子的生成和扩大气道,进一步表明HO-1在COPD发病中的作用。吸烟时烟雾能增加肺泡巨噬细胞HO-1的表达〔7,8〕。据 Matsumoto等〔9〕及 Li等〔10〕发现,HO-1 在 COPD 患者中的抗氧化调节作用可能发生的机制为:外源性的氧化剂导致机体氧化/抗氧化失衡,升高 HO-1水平。报道显示〔11〕,HO-1基因的多态性与肺气肿易感性息息相关。Shinohara等〔6〕发现,大鼠肺组织腺病毒介导的HO-1 cDNA转染降低弹力蛋白所致的肺气肿程度。Yamada等〔11〕证明HO-1基因的多态性与肺气肿易感性关系密切。本研究结果提示HO-1可能在COPD的发病过程中起保护作用,与上述研究结果较为一致。大蒜素是大蒜中提取得到的,有报道指出,作为天然的广谱抗生素,大蒜素能够利用捕获自由基来增加细胞内多种抗氧化酶的表达水平〔12〕。使用大蒜素作用肺泡上皮细胞6 h后,能升高细胞内的γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(GCS)的表达水平〔13〕,提示大蒜素作用后细胞内的谷胱苷肽(GSH)含量增加可能与γ-GCS关系密切。本实验提示大蒜素可能通过HO-1来增加γ-GCS的表达来改善COPD。

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3 Cao J,Inoue K,Li XY.Physiological significance of hemeoxygenase in hypertension〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2009;41(5):1025-33.

4 Welsh MJ,Gaestel M.Small heat-shock protein family:function in health and disease〔J〕.NY Acad Sci,1998;85(8):128-35.

5 Di Filippo C,Marfella R,Cuzzocrea S,et al.Hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic rat increases infarct size associated with low levels of myocardial HO-l during ischemia/reperfusion〔J〕.Diabetes,2005;54(3):803-10.

6 Shinohara T,Kaneko T,Nagashima Y,et al.Adenovirus-mediated transfer and overexpression of heme oxygenase 1 cDNA in lung prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis via a Fas-Fas ligand-independent path-way〔J〕.Hum Gene Ther,2002;13(16):1945-60.

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8 Slebos DJ,Kerstjens HA,Rutgers SR,et al.Haem oxygenase-1 expression is diminished in alveolar macrophages of patients with COPD〔J〕.Eur Respir,2004;23(4):652-3.

9 Matsumoto H,Ishikawa K,Itabe H,et al.Carbon monoxide and bilirubin from home oxygenase-1 suppresses reactive oxygenspecies generation and plasminogen activator inhibitor-1 induction〔J〕.Mol Cell Biochem,2006;291(1-2):21-8.

10 Li MH,Jung JH,Na HK,et al.Carbon monoxide produced byhome oxygenase-1 in response to nitrosative stress induces expression of glutamate-cysteine ligase in PC12 cells via activation of phosphatidylinositol 3-kinasc and Nr12 signaling〔J〕J Biol Chem,2007;282(39):28577-86.

11 Yamada N,Yamaya M,Okinaga S,et al.Microsatcllitc polymorphism in the home oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to emphysema〔J〕.Am J Hum Genet,2000;66(1):187-95.

12 高崴崴,夏熙郑.HO-1与γ-GCS在COPD大鼠肺组织中的表达及大蒜素的治疗作用〔J〕.中国现代医药杂志,2011;13(1):22-4.

13 熊丽红,丁 亮,李 冰,等.大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2006;29(6):368-71.

R541.61

A

1005-9202(2015)09-2353-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.019

辽宁省科技厅计划项目(No.2013225305)

张一兵(1961-),男,硕士,教授,主任检验师,硕士生导师,主要从事临床内科疾病研究。

徐 冰(1974-),女,在读硕士,主治医师,主要从事临床内科疾病研究。

〔2013-12-21修回〕

(编辑 苑云杰)

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