胥孜杭 刘菲 邹纯朴 朱诗国 陈晓

[摘要] 目的 肺癌的发病率和病死率居高不下，而目前用于实验研究的肺癌动物模型存在较大的局限性，故本研究认为建立一个稳定、类似于人体肿瘤微环境的肺癌原位模型是深入研究肺癌的基础。 方法 直接将稳定表达虫萤光素酶的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶的混悬液注射于C57 BL/6小鼠左肺，无需打开胸腔只需将小鼠左胸部皮肤剪开约1 cm小口，定期利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况，并将小鼠处死后立即进行肺部组织活体取材，采用石蜡包埋、切片、HE染色做出病理学诊断。 结果 采用肺内注射的原位造模法成瘤率高，Lewis肺腺癌细胞数量只需0.5×105个即可成瘤，成功率达90%以上，且利用活体成像系统中的生物发光技术能监测到模型小鼠肿瘤可转移至对侧胸廓、对侧肺组织、双侧腋下及腹股沟淋巴结等。 结论 注射虫萤光素酶稳定表达的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶混悬液构建的肺癌原位模型所需细胞数量少，成瘤率高，无手术死亡风险，转移性好，监测方便，操作简单且可重复性高，为深入研究肺癌提供了良好模型。

[关键词] 肺癌;原位模型;活体监测

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2015）01（a）-0015-04

Establishment of orthotopic lung cancer model in mice

XU Zihang   LIU Fei   ZOU Chunpu   ZHU Shiguo   CHEN Xiao

School of Basic Medical Science， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai   201203， China

[Abstract] Objective Morbidity and mortality remain high in lung cancer， but the animal lung cancer models used for the experimental research are limited， so to establish an orthotopic lung cancer model， which is stable and similar to the human tumor microenvironment， is a foundation for the further study of lung cancer research. Methods Luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix were directly injected into the left lung of C57BL/6 mice after cutting open a incision of the skin， which about 1 cm， and there was no need to open the chest. Small animal in vivo bioluminescence imaging system was used to monitor tumor growth and metastasis. At different time points， mice were sacrificed and the lung tissues were isolated and imbedded with paraffin. Pathological diagnosis was made by sliced and HE stained. Results LLC cells （0.5×105） were enough to form an orthotopic pulmonary tumor， and the success rate was above 90%. The metastases to contralateral thoracic， contralateral lung， bilateral axillary and inguinal lymph nodes were monitored by bioluminescence technique. Conclusion The orthotopic tumor models of lung cancer can successfully built by injection of luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix mixture. Furthermore， a few LLC cells are needed， and the tumor formation rate is high， besides there is no operation death risk. It has good metastases and high repeatability， in addition it's easy to operate and easy to be monitored， which provides a good method for the establishment of mouse models for further study of lung cancer.

[Key words] Lung cancer; Orthotopic model; Live monitoring

目前肺癌的发病率无论在国内还是国外都已位居各类肿瘤发病率的前列，在国内还呈现逐年上升的趋势，其中约80%的肺癌都属于非小细胞肺癌[1-3]，这引起了无论是西医还是中医、临床还是实验室的广泛重视。但想要更深入地研究肺癌，稳定、逼真（类似于人体肿瘤微环境）的动物模型是所有研究的基础。

目前，肺癌动物模型的构建方法有化学诱导法、转基因法、异位移植法、原位移植法等。其中化学诱导模型耗时长，且诱导出来的肿瘤存在较大异质性[4]，故有使用局限。转基因模型虽对肺癌早期的发病机制及干预性治疗效果的研究有很大帮助，但是由于该模型存在造模时间难掌握、花费较高、数量上难以满足实验要求以及转基因产物不一定符合要求等问题[5]，故亦存在普遍使用的局限性。在过去的几十年中，异位移植法中的皮下移植是对肺癌进行实验研究的首选方法[6]，由于其操作简单方便，通常只需在背部、腋部、后肢接种即可，但如今采取此种方法构建的肺癌模型所得出的实验数据常遭到学者们的质疑，认为其脱离了源组织的微环境，导致实验结果与临床治疗效果差异较大[7]，此外，早在1989年外国学者Paget[8]的种子和土壤学说也证实了器官微环境会影响肿瘤细胞的表型表达，而皮下移植瘤模型转移发生率较小，并且生存曲线的数据不准确。原位移植法包括支气管内注射[9]、肺内注射[10-12]，以及外科植入新鲜肿瘤组织[13]。其中支气管注射成瘤及瘤体大小、数目均不稳定，故使用局限性较大。相关实验证明，在肺癌原位移植模型中，瘤块外科原位移植法比肿瘤细胞悬液原位注射法转移率高，转移的发生也具有与临床相似的时间依赖性，但是由于其创伤大、手术病死率高、实验动物生存时间短，不宜普遍推广[13]。而本研究构建的肺癌原位模型是在以往的肺内注射法的基础上继续改良创新，以期构建出更为理想的小鼠肺癌原位模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系  Lewis肺癌（lewis lung carcinoma，LLC），源于C57 BL/6小鼠，属鼠源性的非小细胞肺癌细胞株，购于中科院。

1.1.2 细胞转染所需材料  转染试剂Lipofectamine 2000TM购于Invitrogen公司，潮霉素（Hygromycin B）购于Roche公司，RPM1-1640购于HYCLONE公司，OPTI-MEMI购于Invitrogen公司。

1.1.3 实验动物  C57 BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司（SCXK（沪）2007-0005），雄性，5周龄，17只，体重18～22 g。所有小鼠在SPF级屏障系统中饲养[实验室使用许可证编号：SYXK（沪）2009-0069]。饲养室相对湿度为（55±10）%，温度为（22±2）℃，光照12 h明暗交替，小鼠所用饲料为上海仕林生物科技有限公司生产的辐照鼠料。

1.1.4 matrigel基质胶/基底膜  BD MatrigelTM matrix Basement Membrane（BD公司，产品编号：356234）标准型浓度，-20℃下冷冻保存，避免多次冻融。

1.1.5 活体成像仪器  Caliper精诺真生物发光/荧光活体分子成像系统（IVIS？誖 Lumina XR Imaging System）[铂金埃尔默（Perkin Elmer），型号：Lumina XR]，成像图片分析软件：LuminaⅡliving image 4.3。

1.2 方法

1.2.1 构建表达荧光素酶的LLC稳转细胞系  本实验所用质粒载体是EGFP-FFLuc-HyTk-pMG^pac，该载体同时表达绿色荧光蛋白（GFP）、虫萤光素酶（luciferase）、潮霉素（hygromycin B）和自杀基因（Tk基因），是由本研究组通过材料转移协约（material transfer agreement，MTA）从德州大学MD安德森癌症中心获得。用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPM1-1640培养液培养LLC细胞。转染前将细胞接种于35 mm培养皿中，置于5%CO2，饱和湿度的37℃培养箱中培养。当细胞达到70%～80%融合浓度时开始转染。转染24 h后加入600 μg/mL的潮霉素进行抗性克隆筛选，挑选GFP阳性克隆，然后用300 μg/mL的潮霉素进行维持。

1.2.2 动物模型的建立  ①配制细胞混悬液：将含有表达虫萤光素酶的LLC细胞（0.5×105个）50 μL的细胞悬液与50 μL的matrigel基质胶等体积混匀，将其抽吸入事先预冷好的胰岛素注射器。②麻醉固定：使用浓度为1%、剂量为5 mg/kg的戊巴比妥钠将小鼠麻醉固定。③剃毛：用剃毛器将小鼠左胸部及腋下的黑毛剃除干净，以充分暴露左侧胸壁。④剪开皮肤：于小鼠左腋前线下1 cm处用左手持镊子将皮肤拎起，右手持眼科手术剪将皮肤横向剪开约1 cm的小口。⑤定位：观察小鼠心脏搏动处，将心脏定位好后再水平向左移动皮肤切口，可发现与心脏暗红色组织不同的白色实质性的左肺组织。⑥进针：定位好后将事先抽吸好的胰岛素注射器插入左肺，进针深度3 mm，角度以垂直为佳，注射完后停顿5～10 s，再在伤口上滴洒含庆大霉素的生理盐水少许。⑦缝合：切口缝合1～2针。⑧伤口护理：最后在伤口上涂抹红霉素眼膏，帮助伤口愈合，造模完成。

1.2.3 小动物活体成像操作方法  小鼠于造模后进行活体成像，首先给予小鼠腹腔注射虫萤光素酶底物，浓度为15 mg/mL，剂量为150 μL/只，底物作用时间5 min，5 min后予以异氟烷吸入麻醉5 min，然后再放入主机箱内，曝光10 s后进行图像拍摄。构建原位模型，于小鼠左肺注射等比例的LLC-虫荧光素本酶细胞（0.5×105个）与matrigel基质胶混悬液共100 μL。同一只小鼠按上述方法造模后分别于术后的第4、11、18天进行活体成像。

2 结果

2.1 稳定表达虫萤光素酶的LLC细胞系构建完成

由于EGFP-FFLuc-HyTk-pMG^pac载体在同一启动子下表达EGFP（增强型绿色荧光蛋白）和虫荧光素本酶，因此，EGFP的表达代表了虫荧光素本酶的表达。如图1（封三）所示，LLC细胞在转染EGFP-FFLuc-HyTk-pMG^pac质粒DNA后，稳定表达EGFP，表示稳定表达虫荧光素本酶的LLC细胞系构建成功，可以用于进一步研究。

2.2 小动物活体成像结果

将模型小鼠于造模后的第4天按照上述操作方法进行第1次活体成像，结果如图2（封三），共造模17只小鼠，除第8号小鼠出现腹腔种植转移外，其他16只小鼠均在胸部出现明显荧光素酶信号，表示在胸部有肿瘤形成，其造模成功率为94%。

2.3 病理学检测

小鼠活体成像结果说明在小鼠胸部有肿瘤形成，进行病理检查进一步明确肿瘤在肺组织内而非在胸腔内。按照常规病理切片流程，取材：将10只小鼠于术后第4天活体成像后处死并立即进行活体取材，取出肺组织，此时肉眼观察肺组织尚未见明显的病变表现;接着使用10%中性福尔马林溶液肺部灌流、固定;二甲苯透明、浸石蜡、包埋、切片、HE染色：二甲苯脱蜡2次，各10 min，无水乙醇漂洗二甲苯2次，各1 min;95%酒精1次，1 min，90%酒精1次，1 min，85%酒精1次，1 min，自来水冲洗2 min;苏木精染色4 min，自来水冲洗1 min;1%盐酸酒精分化20 s，自来水冲洗1 min，伊红染色1 min，自来水洗30 s;梯度酒精脱水：70%酒精1次，20 s，90%酒精1次，20 s，95%酒精2次，各1 min，无水乙醇2次，各2 min;二甲苯透明2次，各3 min;中性树胶封片。显微镜下鉴定小鼠左肺肿瘤病灶，有荧光信号的左肺经病理学检测后证实为肿瘤组织（图3，封三）。

2.4 模型小鼠大体解剖结果

于小鼠术后第18天进行第3次活体成像，成像后给予小鼠脱颈处死并对其进行解剖，观察模型小鼠肿瘤生长及转移情况，如图4（封三），可见有荧光信号的左侧肺部也正是解剖后左肺背部（进针部位）有明显深红色或白色肿瘤组织的地方，质地较硬，贯穿于整个左肺，在右肺、对侧胸腔还可见散在的白色肿瘤组织。

2.5 模型小鼠肿瘤形成及转移情况的监测

模型小鼠于术后第4天进行第1次活体成像，于第11天进行第2次活体成像，于第18天进行第3次活体成像，以监测小鼠肿瘤形成及转移情况。3次活体成像的条件，如底物浓度、底物作用时间、麻醉时间、曝光时间、标尺等均为一致，成像结果如图5（封三），可见模型小鼠在没有药物干预的情况下，肿瘤细胞的荧光信号强度显现出时间依赖性（随着时间增加而增强、增多），从第4天左肺较弱的蓝色信号，至第18天整个胸廓出现红色的强信号，说明本研究采用的虫萤光素酶标记的LLC细胞所进行的生物发光法确实可以较好地监测小鼠体内肿瘤形成及转移情况。

3 讨论

3.1 原位模型构建四大关键点

第一，尽可能保证每只小鼠所注射的细胞数量的均一性。手术时所用的matrigel基质胶是为了让肿瘤细胞固定在局部，成为其生长的支架，有助于形成单一病灶，但matrigel基质胶具有遇高温凝固的不可逆性，所以据笔者经验，须事先将细胞悬液与matrigel基质胶在超净台中等比例充分混匀后抽吸入胰岛素注射器内（注意：凡与matrigel基质胶接触的用品均需预冷），以确保每只小鼠注射的细胞数量的一致性，抽吸完毕后立即将注射器插入事先准备好的冰盒中。第二，在手术过程中最为关键的就是定位，手术切口在左腋前线下1 cm处，切口为横向切口，首先找到心脏搏动处，其颜色为随心脏起伏的暗红色组织，与心脏平行的左侧就可看见与搏动的暗红色组织形成对比的白色实质性的左肺，此时方可进针。第三，如图2所示，8号小鼠于造模后第4天进行第1次活体成像时荧光信号布满了整个腹腔，说明注射器可能刺进了心脏，导致细胞与matrigel基质胶的混悬液直接参与了血液循环，所以强调进针的深度以3 mm为佳（小鼠肺叶厚度在3 mm左右）。第四，左肺进针注射完毕后，不要急于出针，需停顿5～10 s，以防混悬液渗漏被注射器带出。

3.2 肺癌原位模型的构建对中医药抗肿瘤的意义

首先，从中医藏象理论出发，肺癌异位移植与原位移植在病位、病理变化上有很大的差别。有研究显示，两种不同的移植方式在肿瘤的形成过程中对缺氧的反应也表现出截然不同的结果[14]。而肺癌原位移植不仅可以制造出局部的肿瘤病变，而且还可以模拟肺脏受损后肺功能失常的一系列生理、病理变化，故原位移植模型更符合临床实际。其次，从中药作用的机制出发，不同的中药对各个脏腑经络有各自的指向作用，即所谓的“归经”，如治疗肺癌的常用化痰药物：天南星、半夏、鱼腥草、贝母、射干等，他们的“归经”都是肺脏，即这些药物在对肺脏其本身的病变有更好的治疗效果。有研究发现，有些中药对原位移植的肺癌模型小鼠有效但对皮下移植的模型小鼠效果差甚至无效，反之，有些中药可能对皮下移植的肿瘤效果好，而对原位肿瘤效果不佳，从而产生药物治疗效果的假阳性[15]。可见，采用异位移植模型得到的实验结果与临床应用的实际效果之间存在较大差距，而原位模型的建立可以很好地解决以上存在的问题。原位移植法不仅可提高肿瘤成瘤率，突显肿瘤的侵袭和转移特性，还可观察肿瘤血管的生成情况，从更大程度上模拟了人体肺部肿瘤的微环境[16]，同时也提升了模型实验数据的可信度，故成为了研究关注的焦点。所以，肺癌原位模型的建立对于中医药抗肺癌无论是从理论角度还是从科研的角度来说都是至关重要的。

综上所述，本研究所构建的小鼠肺癌原位模型，因其只需剪开皮肤，不流血，创伤小，无手术死亡现象，且所需细胞数量少，成瘤率高，转移性好，操作简单，可重复性强，大幅度地提升了肺癌原位模型的成功率，同时还可利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况，为深入研究肺癌奠定了基础，也为中医药抗肺癌踏入国际舞台奠定了基础。

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（收稿日期：2014-09-01  本文编辑：任  念）